淺談重組糖蛋白激素的生物效價與質(zhì)量控制論文
已發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素主要是由脊椎動物垂體前葉細(xì)胞合成和分泌的促黃體激素、促卵泡激素和促甲狀腺激素，以及胎盤產(chǎn)生的人絨毛膜促性腺激素。被稱為促性腺激素，通過調(diào)節(jié)性腺內(nèi)配子發(fā)生和類固醇激素合成來促進(jìn)辜丸和卵巢的功能，臨床主要用于輔助生殖(促進(jìn)卵泡發(fā)育、成熟及排卵)，治療不孕不育癥，調(diào)節(jié)甲狀腺的生化和生理過程，促使甲狀腺素的合成和分泌，臨床用于該激素缺乏狀況的檢查或替補(bǔ)性短暫維持，在甲狀腺疾病的治療中扮演重要角色，如用于分化型甲狀腺癌的診斷和隨訪，用于刺激清除殘留甲狀腺以及治療甲狀腺癌轉(zhuǎn)移灶，用于刺激治療非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫以及提高低分化甲狀腺癌化療療效等。過去，這類制品來源于垂體或尿液提取物，成分復(fù)雜�，F(xiàn)在已實(shí)現(xiàn)基因重組技術(shù)生產(chǎn)，成份單一。重組人LH、重組人FSH、重組HCG和重組人TSH已先后被批準(zhǔn)上市。生物效價是糖蛋白激素質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，隨著對高純度重組產(chǎn)品理化結(jié)構(gòu)與生物功能關(guān)系認(rèn)識的不斷深入和積累，研究發(fā)現(xiàn)糖蛋白激素制品的體內(nèi)生物活性高度依賴糖基化的一致性，因此，現(xiàn)已逐步趨向于以理化指標(biāo)的檢測代替經(jīng)典的生物活性測定方法。本文對影響生物效價的關(guān)鍵因素、質(zhì)量控制中的關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行梳理回顧，進(jìn)而分析探討糖基化修飾控制對生物效價、批間一致性的重要性。
1生物效價的定義
糖蛋白激素生物效價量值“單位”是一個抽象的概念，通過參照標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)其在生物系統(tǒng)(體內(nèi)或體外)產(chǎn)生特定生物反應(yīng)的強(qiáng)弱，確定效價即生物活性。早期沒有標(biāo)準(zhǔn)品時，通過測定其內(nèi)分泌生理功能，定為動物單位，如HCG定義1個鼠單位為可從陰道涂片觀察到雌幼齡大鼠發(fā)情所注射的HCG的量，從絕經(jīng)婦女尿中提取的尿促性腺激素也是相同定義。其缺餡為:沒有特異性，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，無法實(shí)驗(yàn)室之間比較[[9]。因此世界衛(wèi)生組織通過建立國際標(biāo)準(zhǔn)品，確定國際單位，對第1次或國際參考品通過組織國際間協(xié)作標(biāo)定，最終達(dá)成共識而定義IU數(shù)值�，F(xiàn)在重組糖蛋白激素除:HCG外，rhFSH，rhLH和rhTSH都已有，除rhTSH的是定義的IU外，rhFSH和rhLH的IU由提取的FSH和LH標(biāo)定而來。標(biāo)準(zhǔn)品一般原則為數(shù)值上保持連續(xù)性，由上一次標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定下一次標(biāo)準(zhǔn)品;每一標(biāo)準(zhǔn)品有專門用途，只供生物測定用或只供免疫測定用;使用時遵循“同質(zhì)”原則，如對rhFSH產(chǎn)品要用rDNA的標(biāo)準(zhǔn)品檢測，不能用尿源的。標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的建立和溯源是生物效價量值測定和賦值的重要基礎(chǔ)，生物制品活性或效價測定正是通過生物體外或體內(nèi)試驗(yàn)方法并與標(biāo)準(zhǔn)品或參考品對照而得，重組糖蛋白激素生物類似藥的研發(fā)過程中，生物活性檢測被認(rèn)為不僅是產(chǎn)品性質(zhì)研究的一部分、批間分析鑒定的重要檢測項，同時也是產(chǎn)品結(jié)構(gòu)確證的有力補(bǔ)充，可反映產(chǎn)品的作用機(jī)制，從而與臨床應(yīng)用聯(lián)系起來。
2糖基化的異質(zhì)性與質(zhì)量控制
糖蛋白激素家族是各由1個。啞基和1個p-亞基組成的異質(zhì)二聚體，以非共價鍵結(jié)合，所有的。-ZL基都是相同的人�；L92個氨基酸，而和TSH的p啞基氨基酸殘基各不相同糖鏈與膚鏈部分以共價方式結(jié)合，通常連接在天冬酞胺上，稱為N寡糖側(cè)鏈啞基的C末端比LH延長了24個氨基酸，稱為竣端膚，其上含有4個糖鏈連接于絲氨酸殘基，稱為U寡糖側(cè)鏈。重組糖蛋白激素異質(zhì)性也是由于糖基化的不均一導(dǎo)致存在多種異型體，同一種激素，唾液酸含量、糖鏈長度、分枝類型與末端的變化，造成糖蛋白激素分子結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，LH與FSH存在近百種異型體。寡糖側(cè)鏈具有甘露糖,酞葡萄糖胺組成的核心結(jié)構(gòu)，延伸的分支末端有半乳糖、巖藻糖、唾液酸等，糖側(cè)鏈比糖側(cè)鏈更加多樣復(fù)雜化，沒有共同的核心結(jié)構(gòu)唾液酸含量的變化是導(dǎo)致糖基化不均一的關(guān)鍵，重組糖蛋白激素的'活性是由該混合物異型體結(jié)合到靶組織而達(dá)到的效果。指導(dǎo)原則(生物技術(shù)產(chǎn)品和生物制品的檢驗(yàn)方法和可接受標(biāo)準(zhǔn))對重組糖蛋白的異質(zhì)性，指出“這些異型體可能有活性，不會對產(chǎn)品的安全性和有效性產(chǎn)生不利影響，如已證明每批產(chǎn)品的異型體是一致的，就不必對每一種形式的活性、安全性和有效性進(jìn)行評價，這些異型體決定了它們的質(zhì)量，對異質(zhì)體可當(dāng)作相關(guān)物質(zhì)加以鑒定，確保批與批間一致性”。由此可見批間一致性是質(zhì)量評價的關(guān)鍵。為保證批次間亞型分布的一致性，對相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)(降解或聚合物)需進(jìn)行必要的分析。如以反相高效液相色譜對重組糖蛋白激素進(jìn)行膚圖分析;采用RP}IPLC檢測。和}-ZL基氧化產(chǎn)物;通過十二烷基硫酸鈉嗜食丙烯酞胺凝膠和排阻高效液相色譜法檢測游離亞基與多聚體含量;等電點(diǎn)聚焦電泳技術(shù)鑒別亞基分布，檢測主色帶和等電點(diǎn)范圍等，并與內(nèi)部對照品比較，對所有色帶的物質(zhì)進(jìn)行控制。總之，控制產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)與物質(zhì)的種類和含量是該類產(chǎn)品質(zhì)量評價的重要內(nèi)容，是保證批間一致性的前提。
3糖譜分析及值與效價關(guān)系
大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)N寡糖側(cè)鏈上唾液酸與糖蛋白激素的等電點(diǎn)、代謝清除率和生物活性密切相關(guān)，唾液酸含量越高，pI越低，生物活性越高，pI與體內(nèi)生物活性間具有高度相關(guān)性(r=0.95}P<0. 01)，以化學(xué)或酶制劑去糖基化后，皆喪失激素活性,LH和HCG去除唾液酸后，雖仍能與受體結(jié)合，具有體外活性，但卻無體內(nèi)活性，因已被從體內(nèi)快速清除。高唾液酸結(jié)構(gòu)，降低了糖蛋白激素的pI，低pI的糖蛋白在體內(nèi)與肝網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性蛋白受體結(jié)合力降低，導(dǎo)致消除率降低，體內(nèi)半衰期延長，如pI=4.27的rFSH比pI =5. 49的半衰期長1倍，而以神經(jīng)氨酸酶去唾液酸后，HCG的半衰期從50 min降至1 min。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究正是基于它們的物理化學(xué)性質(zhì)及對效價的影響因素，關(guān)鍵是N梅氰糖側(cè)鏈上唾液酸含量，因0-寡糖側(cè)鏈分子上唾液酸化水平與生物活性的相關(guān)性小圈，因此N寡糖側(cè)鏈的糖基化分析和唾液酸含量是保證重組糖蛋白激素具有生物效價的關(guān)鍵，糖譜分析是質(zhì)量評價的重要內(nèi)容，通過與對照品比對糖譜，及Z值計算，確保批間一致性。Z值是一假設(shè)參數(shù)，按不同種唾液酸比例評價唾液酸化程度，采用陰離子交換高效液相色譜和熒光檢測儀分析糖譜，半定量分析相同唾液酸數(shù)量的寡糖百分比，即按糖鏈多聚糖所帶電荷數(shù)，洗脫分離唾液酸化組分為中性唾液酸化組分及單、二、三、四、五唾液酸化組分，各自組分糖所占色譜峰面積除以所有組分糖總面積的百分比(A)乘以其相應(yīng)電荷之和為Z值。由于糖側(cè)鏈上唾液酸無生物活性，故Z值只需計算N寡糖鏈多聚糖，可通過一種高特異性酶膚N糖昔酶F，選擇性在蛋白質(zhì)N鏈接位點(diǎn)將完整的N}糖鏈作為葡萄糖胺類完整裂解下來，酶解消化釋放出完整的N寡糖側(cè)鏈聚糖。Z值具有高度的準(zhǔn)確性(回收率91%一108 %)和精密度( RSD < 2% )，是特征參數(shù)，代表N寡糖側(cè)鏈上唾液酸化水平，能檢測出不同生物活性的批次間糖基化的差異，效價低的Z值小，僅攜帶甘露糖無唾液酸的糖基化結(jié)構(gòu)(Z = 0 ); rhLH和rHCG的Z平均值分別184,15。和150 }zo7，每一產(chǎn)品有其固定Z值范圍，故糖蛋白激素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中Z值不可缺少，如某公司生產(chǎn)的rhFSH產(chǎn)品3年內(nèi)生產(chǎn)的120批Z值在177-200，表現(xiàn)出高度批次間一致性。因此糖譜和Z值成為評價糖基化水平和重組糖蛋白激素質(zhì)量、保證其具有生物活性和批間一致性的重要指標(biāo)。
4含量測定與效價關(guān)系
根據(jù)ICHQ6B規(guī)定:當(dāng)藥物的物理化學(xué)信息(包括高級結(jié)構(gòu))可以通過理化方法確定，并能證明與生物活性有相關(guān)性，以及存在完整的歷史生產(chǎn)檔案，含量與生物效價間形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化值時，就可以用準(zhǔn)確、精密的理化方法測定含量(林g或mg)代替生物效價。是測定重組促性腺激素蛋白含量的常用方法，精密度高;對rhTSH則以ELISA法測定含量。生物效價與含量之比為比活性，rhFSH ，rhLH ，rHCG比活性分別為>10 000 9 000，大大高于提取產(chǎn)品，并且糖型結(jié)構(gòu)也要簡單的多。與受體結(jié)合后產(chǎn)生的生理效應(yīng)是重組糖蛋白激素所有異型體的綜合效應(yīng)與制劑的量相關(guān)，受體結(jié)合反應(yīng)依賴產(chǎn)品的準(zhǔn)確劑量，而產(chǎn)品亞型分布、糖基化的一致性是前提。當(dāng)經(jīng)過長期考察批次間高度一致的產(chǎn)品，符合要求時，如某公司的rhFSH產(chǎn)品，7年內(nèi)多批rhFSH原液，批與批次間高度一致，比活性穩(wěn)定，呈正態(tài)分布，效價與蛋白含量間存在固定關(guān)系，故以含量標(biāo)識回，取代在常規(guī)生產(chǎn)檢定中誤差大(RSD 20% )，耗費(fèi)人力、物力，傷害動物的體內(nèi)生物檢定方法，以理化分析的方法代替，用于成品的質(zhì)量控制。研發(fā)重組糖蛋白激素生物類似藥企業(yè)，可積累數(shù)據(jù)，在確保批間一致性、工藝穩(wěn)定條件下，使含量測定成為常規(guī)生產(chǎn)中的質(zhì)量控制方法，而取代生物測定。
5展望
重組糖蛋白激素現(xiàn)階段表達(dá)于CHO細(xì)胞，已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)條件高度自動化、可控性強(qiáng)，純化工藝穩(wěn)定，制品純度和比活性高，如rhFSH純度可達(dá)到>99 %，純度和比活性高(>99%)，未見免疫原性問題報道。通過生產(chǎn)過程的嚴(yán)格監(jiān)控保證質(zhì)量的穩(wěn)定與批次間的高度一致性。
基于糖蛋白激素的構(gòu)效關(guān)系，實(shí)現(xiàn)在CHO細(xì)胞的共表達(dá)，由此制備的長效rhFSH，商品名:已被批準(zhǔn)上市;另有將FSH與免疫球蛋白的恒定區(qū)片段(Fc)融合，制備融合蛋白，得到長效rhFSH的報道。通過對它們的質(zhì)量研究與評價，不斷完善與生物效價相關(guān)的關(guān)鍵指標(biāo)，來確保產(chǎn)品的一致性。
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