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探研富血小板血漿在口腔組織再生中應(yīng)用的影響因素
富血小板血漿(platelet—rich plasma，PRP)是從20世紀(jì)60年代用于止血治療開始應(yīng)用于臨床，1998年Marx首次把PRP與自體髂骨結(jié)合應(yīng)用于下頜骨缺損重建治療中。目前，富血小板血漿定義為利用離心技術(shù)使得少量血漿中自體血小板濃縮，并通過凝血酶和CaC1，的激活使得血小板中的儀鏈釋放其含有的生長因子和黏結(jié)蛋白，其同義詞包括血小板凝膠、富生長因子血漿、富血小板纖維等。本文對PRP在口腔組織再生中應(yīng)用的影響因素做一綜述。
1 PRP
1.1 PRP中的生長因子和黏結(jié)蛋白儲存于血小板a鏈中的生長因子包括血小板衍生生長因子 (platelet—derived growth factor PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子B(transforming growth factorbeta，TGF.B)、血小板衍生血管生成因子(platelet—derived vascular growth factor，PAGF)、血小板衍生上皮生長因子(platelet—derived epidermal growthfactor， PDEGF)、l(insulingrowth factor一1，IGF一1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)等。體外實驗也證實PRP中還含有3種黏結(jié)蛋白， 即纖維蛋白原、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白，這三種分子可作為骨或結(jié)締組織的基質(zhì)。也可作為細(xì)胞間的連接分子并以此起著骨誘導(dǎo)的作用。
1.2 PRP的制取方法
隨著設(shè)備和技術(shù)的改進，目前各種PRP制取系統(tǒng)都是采用相類似的機制。其流程可簡述為：
①一般從病人前臂靜脈中采集少量全血(用于牙周組織再生治療的全血量為8～10 mL.用于頜骨重建治療的全血量為8～500 mL)。
�、� 低轉(zhuǎn)數(shù)離心分離：分離出含血小板與紅細(xì)胞的上清液及去血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，棄除去血小板血漿。
�、� 高轉(zhuǎn)數(shù)離心分離：紅細(xì)胞與比重大的PRP分離，去紅細(xì)胞。
�、� 激活并形成凝膠狀：添加自體或異體凝血酶和CaC12.
1.3 組織再生中PRP作用機制
富血小板血漿作用的發(fā)揮在于其所含的大量生長因子和蛋白在受區(qū)的持續(xù)性釋放。這是岡為這些來自 鏈的多肽分子能夠調(diào)控細(xì)胞的遷移、附著、增殖、分化.并通過與特定的細(xì)胞表面受體結(jié)合進而促進胞外基質(zhì)的堆積，并以此能夠模擬傷口的生理性愈合過程以及組織的修復(fù)過程嗍�；谶@些理論，PRP能夠促進移植物的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性和黏結(jié)性，改善骨組織和軟組織的愈合進而縮短術(shù)后愈合時間，此外還可以抵消移植物的吸收。
2 影響PRP在口腔組織再生中應(yīng)用的因素
盡管理論上認(rèn)為PRP有利于組織再生.但從現(xiàn)有的相關(guān)文章報道可以發(fā)現(xiàn)，有關(guān)PRP是否有利于口腔組織再生存在很大爭議。在動物實驗中，Jakse等在羊上頜竇提升模型中發(fā)現(xiàn)實驗組(T)與對照組(C)的組織切片中新骨形成比例不存在顯著差異(T：自體髂骨+PPR;C：自體髂骨);而Ohya等 在兔上頜竇提升模型中證實PRP促進骨形成; 國內(nèi)學(xué)者何家才等在犬下頜骨種植周圍缺損模型中也發(fā)現(xiàn).實驗組(TCP+PRP)的種植體骨結(jié)合率和新骨形成質(zhì)量明顯優(yōu)于對照組(TCP+生理鹽水)。在臨床試驗中，DOri等發(fā)現(xiàn)實驗組(T)與對照組(C)問在臨床附著水平上無顯著差異(T：B—TCP+PRP;C：13一TCP)：Piemontese等證實PRP有助于臨床附著水平的增加 通過對文獻的回顧，我們發(fā)現(xiàn)影響PRP促口腔組織再生實驗結(jié)果差異的因素可以歸納為兩大類：第一類為與PRP相關(guān)的因素;第二類為與實驗設(shè)計相關(guān)的因素。
2.1 與PRP相關(guān)的影響其作用的因素
2.1.1 PRP巾血小板濃度
Marx最早測算出PRP中血小板濃度平均較術(shù)前全血中增加了3.38倍。Weibrich等在比較PRP中血小板不同的濃度對成骨影響的實驗巾發(fā)現(xiàn)，濃縮度在2～6倍時實驗組與對照組在熒光標(biāo)記的骨量上存在顯著差異，但濃縮度在6～11倍時卻顯示有抑制成骨細(xì)胞活性的作用。Weibrich由此也提出當(dāng)PRP中血小板計數(shù)在1×10 / I 時PRP呈現(xiàn)出最好的生物學(xué)作用。也有學(xué)者提出1x10e/t~L只是PRP促進組織愈合的最低適合度。目前，對于組織再生有良好臨床作用的最佳血小板濃縮度仍不是很清楚.不過已經(jīng)明確的是：PRP中血小板濃度較低其促組織再生作用將欠佳，如果濃度過高其促組織再生的作用將受抑制 。JlL~b，有學(xué)者認(rèn)為基于最初全血中血小板數(shù)不同，PRP中血小板濃度也將隨著變化。但是Weibrich通過實驗發(fā)現(xiàn)，血小板數(shù)或生長因子水平在全血和PRP之間不存在相關(guān)性 。
2.1.2 PRP促組織再生作用的持續(xù)時間
由于血小板的半衰期僅為8～12 d，有學(xué)者提出PRP在早期有促進骨形成的作用，但隨時間推移這種作用將會減弱或者消失[17.181：有實驗結(jié)果支持此觀點：@Thor等 1有關(guān)上頜竇提升術(shù)骨移植的成骨性實驗發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3個月PRP組與對照組在新骨形成量上存在明 差異.但在術(shù)后6個月兩組問就已無顯著差異;⑦Harnack等[羽有關(guān)PRP在牙周手術(shù)中應(yīng)用的隨機對照實驗發(fā)現(xiàn).傷口愈合指數(shù)在術(shù)后3 d時比較高，但從術(shù)后2周起開始下降。
2.1.3 制取PRP 的不同方法
早在2001年Zimmermann等通過實驗發(fā)現(xiàn)，PRP中血小板濃度隨不同制取方法而存在明顯差異。Weibrich等f6l認(rèn)為目前PRP制取方法大致分為梯度密度細(xì)胞分離法和‘uffv coat’(白細(xì)胞層)法，并指出與 uffv coat’(白細(xì)胞層)法相比梯度密度細(xì)胞分離法產(chǎn)生的血小板數(shù)多，生長因子水平高。Weibrich等 比較了PCCS (濃縮血小板采集系統(tǒng)，platelet concentrationc0liection system)與Curasan(eurasan PRP kit)兩種不同的PRP制取系統(tǒng)，并發(fā)現(xiàn)PCCS系統(tǒng)產(chǎn)生的血小板數(shù)更多，TGF—B與IGF I的濃度更高。
2.1.4 PRP的激活物—— 凝血酶
目前，用于PRP激活的凝血酶主要為兩種來源：一種為自體獲取的人凝血酶：另一種為異種來源的凝血酶，多為牛凝血酶。Su等 分別用人凝血酶和牛凝血酶來制備PRP膠.發(fā)現(xiàn)使用人凝血酶制成的PRP其PDGF和TGF濃度高于用牛凝血酶制成的。
2.1.5 PRP生長兇子的雙重性作用
PDGF和TGF.B都具有刺激或抑制成骨細(xì)胞的作用。此外由于PRP內(nèi)含多種多肽類因子，每個因子對同一組織都有著不同的作用或應(yīng)答，并相互作用，進而形成多種信號分子級聯(lián)表達途徑，最終導(dǎo)致基因的表達和蛋白形成。在一動物模型中，雖然TGF.p在PDGF的激活下被釋放，但在組織學(xué)中并沒有發(fā)現(xiàn)纖維組織的形成。
2.1.6 其他再生材料的影響
在口腔骨組織工程中，骨替代材料分為自體骨、同種異體骨、異種骨、異質(zhì)骨替代材料。其中自體骨是通過骨傳導(dǎo)(osteoconductive)和成骨來促進骨愈合，異體骨是通過骨誘導(dǎo)性fosteoinductive)來促進骨形成，異質(zhì)骨替代材料是通過骨傳導(dǎo)性來促進骨愈合。骨傳導(dǎo)性材料通過支架的作用來支持自體新骨組織生成并逐漸被替代，而骨替代性材料通過材料或生長因子刺激宿主再生來恢復(fù)缺失閉。目前，PRP已與上述各種骨替代材料結(jié)合應(yīng)用于口腔組織再生中。
但有學(xué)者指出：PRP不具有骨誘導(dǎo)性，僅有骨傳導(dǎo)潛能 ，只有當(dāng)宿主重要活細(xì)胞(成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞)存在時PRP才能促進新骨形成舊。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自體骨不存在或移植材料體積過大時，PRP就無法產(chǎn)生有效的刺激作用[281。這些似乎可以解釋PRP與無活力移植材料結(jié)合無明顯促骨形成作用。PRP中的生長因子對巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞有趨化作用，實驗證實當(dāng)上述兩種細(xì)胞在宿主區(qū)過多時會引發(fā)宿主區(qū)組織感染，進而導(dǎo)致B.TCP的早期吸收 。另一動物實驗發(fā)現(xiàn)骨傳導(dǎo)性替代材料可阻礙再生區(qū)空間從而阻止牙周組織再生。
2.2 與實驗設(shè)計相關(guān)的影響PRP作用的因素
目前，有關(guān)PRP在口腔組織再生中作用的實驗部分存在著設(shè)計上的缺陷，這些設(shè)計缺陷可能會掩蓋了PRP在組織再生中的角色。這些與實驗設(shè)計有關(guān)的因素包括病人情況、術(shù)后隨訪期、檢查指標(biāo)等。
2.2.1 人選的病人情況
有無影響實驗的系統(tǒng)病史，口腔衛(wèi)生情況，有無吸煙史，骨缺損的類別，疾病的嚴(yán)重程度等都會影響實驗的結(jié)果。在牙周治療中，垂直骨缺損越多，臨床附著水平增加也越多。一些實驗證實，經(jīng)牙周常規(guī)和再生治療后菌斑控制是影響牙周組織愈合的重要因素之一。
2.2.2 術(shù)后隨訪期
有兩個有關(guān)白體髂骨與PRP結(jié)合運用的實驗.以術(shù)后4個月為隨訪期的實驗得出PRP有利于成骨，以術(shù)后6個月為隨訪期的實驗卻得出相反結(jié)果。這可能與PPR的骨傳導(dǎo)性發(fā)揮在成骨早期有關(guān)。但是，長期的評估是更有利于觀察實驗的臨床穩(wěn)定性。
2.2.3 實驗的檢查指標(biāo)
目前.有關(guān)上頜竇的實驗主要為受植區(qū)骨組織學(xué)檢查，檢驗指標(biāo)多為松質(zhì)骨體積(trabecular bone volume，TBV)、骨體積比、新骨形成比：影像學(xué)檢查，指標(biāo)多為骨密度值。有關(guān)牙周再生的實驗主要為臨床檢測，檢驗指標(biāo)多為臨床附著水平(clinical attachment level，CAL)、牙齦退縮(gingival recession， GR)、牙周袋探診深度(pocketdepth PD) 在一篇有關(guān)PRP與脫鈣凍干骨移植物結(jié)合治療牙周骨內(nèi)缺損的RCT(隨機雙盲對照)試驗中，作者發(fā)現(xiàn)在術(shù)后12個月CAL與PD在實驗組(脫鈣凍干骨+PRP)與對照組(脫鈣凍干骨+生理鹽水)間存在顯著差異，但GR在兩組問無顯著差異。
我們知道，臨床附著水平的增加不僅與骨形成有關(guān)也與纖維結(jié)締組織以及結(jié)合上皮形成有關(guān)。顯然選用CAL做指標(biāo)時，無法辨別附著水平的增加有多少是由于骨形成的，又有多少是由于結(jié)締組織形成的。Plaehokova等指出組織學(xué)評價是對于檢驗PRP成骨作用所必須的。
2.2.4 其他與實驗設(shè)計相關(guān)因素
實驗組與對照組的設(shè)計，樣本量的大小也可能影響實驗的結(jié)果。Gunsolley等 指出，在牙周骨內(nèi)缺損再生治療的實驗中每組樣本量至少為30人。樣本隨機分配不充分，分配隱藏不足或者雙盲不完全的小樣本實驗可能會擴大干擾效果 。
3 結(jié)論
本文綜述了目前影響PRP在口腔再生實驗中結(jié)果不相一致的相關(guān)因素，發(fā)現(xiàn)這些影響因素既有PRP自身的因素也有與實驗設(shè)計有關(guān)的因素。通過這些因素的分析.我們認(rèn)為只有在完全隨機對照雙盲的實驗條件下，并統(tǒng)一與PRP相關(guān)的非生物性因素，才可能發(fā)現(xiàn)PRP在口腔再生實驗中真正的作用，以期有助于PRP在臨床的應(yīng)用。
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