PI-103對多藥耐藥白血病細胞體外作用的研究

PI-103對多藥耐藥白血病細胞體外作用的研究

【摘要】 目的  研究PI-103對耐藥白血病細胞的效果及其機制。方法  四甲基偶氮唑藍（MTT）法研究PI-103對K562及K562/A02細胞增殖的影響，流式細胞術研究細胞內阿霉素濃度的改變。結果  PI-103能顯著抑制兩種細胞株的生長，對敏感和耐藥白血病細胞株具有相同的抑制效果；PI-103能顯著增加細胞內阿霉素的濃度，與阿霉素聯用時，能增加阿霉素對細胞的生長抑制作用，但僅有疊加效應而無協同效應。結論  PI-103對于耐藥白血病是一種有良好應用前景的藥物。
【關鍵詞】 白血病  多藥耐藥  PI-103
        多藥耐藥是急性白血病治療失敗的主要原因，其主要機制是P-糖蛋白（Pgp）高表達，將細胞內的化療藥物“泵”出細胞外，導致細胞內藥物濃度過低，使白血病細胞呈現出耐藥表型。如何繞過Pgp的泵作用，逆轉耐藥，提高白血病的治療效果是當前治療的重要方向。K562/A02是由K562細胞經長期阿霉素誘導和克隆篩選而建立的一個耐藥細胞系[1]，能在2μg/ml阿霉素中長期生存，對阿霉素的耐藥指數在10以上。它高表達Pgp，是體外研究多藥耐藥的一個較好的細胞模型。
        PI-103是一種人工合成的PI3K和mTOR特異性抑制劑。PI3K和mTOR是PI3K/AKT/mTOR信號轉導途徑的重要成員，該信號途徑在腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用。近年來發現PI-103對黑色素瘤[2]、肺癌[3]、神經腫瘤[4]等多種腫瘤具有抑制作用，顯示了較好的抗腫瘤效果。本研究旨在研究它對多藥耐藥白血病細胞株K562/A02的作用。
        1  材料和方法
        1.1細胞株及培養條件  K562及K562/A02細胞株由浙江大學醫學院第一附屬醫院血液病研究所傳代保存。培養基為含10%胎牛血清的RPMI1640（Gibco公司產品），置37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，K562/A02長期以2μg/ml阿霉素（ADM）加壓培養，在實驗前2周撤除阿霉素。取對數生長期的細胞進行實驗。PI-103購自美國cayman公司。
        1.2MTT法測定細胞增殖：取對數生長期細胞，調整細胞濃度，以1×105個細胞/ml的終濃度接種于96孔培養板，加入不同濃度藥物，空白對照組以培養基補足，每孔總體系0.2ml，CO2孵箱內培養24小時（h），加MTT工作液20μl/孔（美國Sigma公司），置CO2培養箱中孵育4h，1000 rpm/min離心，小心吸去上清，加入二甲基亞砜0.2ml/孔，吹打，使紫藍色甲臜沉淀充分溶解。在酶標儀570nm波長處讀取吸光度值（A）。以時間為橫軸，A值為縱軸，繪制細胞生長曲線。實驗重復三次，設復孔三個，取平均值為最終結果。按下列公式計算細胞增殖率：
        細胞生存率=（A處理組-A空白組）/（A對照組-A空白組）*100%
        細胞生長抑制率=1-細胞生存率 
        1.3流式細胞術測定細胞內阿霉素濃度：將0.2μM的PI-103和/或2μg/ml阿霉素與終濃度為1×105/ml的細胞共同孵育24小時，收集1～5×105個細胞，1000rpm離心5min，棄上清。加入適量冷PBS，細胞重懸，1000rpm離心5min，重復2次。以冷PBS重懸細胞，上機行流式細胞檢測。流式檢測激發波長488nm，接收波長575nm。細胞內阿霉素濃度高低以熒光強度為計量單位。
        1.4統計學處理  采用t檢驗，所有數據經SPSS11.5統計軟件分析。
        2  結果
        2.1 PI-103對敏感和耐藥細胞株的生長抑制作用相同
        我們用MTT法檢測了不同濃度PI-103對K562及K562/A02細胞增殖的抑制作用。0.5-5μM的PI-103處理24h后，兩種細胞均呈現出明顯的細胞生長受抑。而且，細胞的生長抑制呈現出劑量依賴性。此外，在相同濃度的PI-103作用下，兩種細胞株的生長抑制率基本相同，差異無統計學意義（P>0.05)。
        2.2 PI-103能增加白血病細胞株對阿霉素的敏感性，但僅有疊加作用
        為進一步了解PI-103與阿霉素是否具有協同抑制白血病細胞增殖作用，我們用0.2μM PI-103與不同濃度阿霉素聯合作用于K562細胞及K562/A02細胞，以MTT法觀察了藥物聯用對兩細胞的生長抑制效果。結果顯示，0.2μM PI-103對K562及K562/A02細胞的抑制率分別為10.5%和16.4%，加用PI-103后，阿霉素對K562細胞的抑制率有所增加，但單用阿霉素組的生長抑制曲線與聯用PI-103組的生長抑制曲線幾乎平行，說明PI-103聯用阿霉素僅有疊加作用，而無協調作用。同樣，在K562/A02組，但單用阿霉素組的生長抑制曲線與聯用PI-103組的生長抑制曲線幾乎平行。說明PI-103聯用阿霉素對K562/A02細胞生長抑制作用也僅有疊加作用，而無協同作用。
        2.3 PI-103能增加耐藥細胞株細胞內阿霉素的濃度
        為明確PI-103增加細胞對阿霉素敏感性的機制，本實驗采用用流式細胞術檢測了細胞內阿霉素的濃度。 
結果顯示，在K562組，未用PI-103時，細胞內阿霉素熒光強度為87.46±3.46，PI-103處理后，細胞內熒光強度升高為107.31±6.13，差異具有統計學意義（P=0.015）。而在K562/A02組，PI-103使細胞內阿霉素熒光強度由79.09±2.97升高至165.94±6.58，差異具有顯著統計學意義（P=0.000）。結果顯示PI-103能顯著增加細胞內阿霉素的濃度，尤其是在耐藥K562/A02細胞中更明顯。
        3  討論
        PI3K/AKT/mTOR信號轉導途徑是細胞生存和增殖的重要途徑，在白血病多藥耐藥的形成機制中也發揮了重要作用。因而，通過抑制PI3K途徑誘導細胞凋亡達到治療白血病尤其是耐藥白血病的目的是一個較好的治療思路[5]。本研究結果顯示，雙向抑制劑PI-103能顯著抑制白血病細胞的增殖，且不受耐藥細胞表型的影響，在耐藥細胞及不耐藥細胞中發揮同樣的抑制生長作用。PI3K/AKT/mTOR信號轉導途徑抑制劑是一種有良好應用前景的藥物。
        本研究發現，在Pgp高表達的細胞株K562/A02中，PI-103能明顯提高細胞內阿霉素的濃度，其增加量明顯高于敏感株K562。其機制可能是由于Pgp的合成受抑制導致的。Tazzari等報道[6]，多藥耐藥蛋白P170的表達是受PI3K/AKT/mTOR信號調控的。Pgp合成減少導致阿霉素被“泵”出減少，細胞內阿霉素濃度提高，從而在一定程度上逆轉白血病細胞的耐藥。

       由PI-103能提高細胞內阿霉素濃度這一結果，作者推論PI-103與阿霉素有聯用有協同作用。但令作者感到意外的是，本結果顯示，二者聯用僅有疊加作用，而無協同作用。這可能與下列原因有關：首先，可能與實驗方法的選擇有關。本實驗采用MTT法研究藥物作用后細胞的增殖，結果顯示，在2μg/ml阿霉素作用下，K562/A02細胞生長顯著被抑制。然而，K562/A02細胞是長期用含2μg/ml的培養基中生長的，僅在實驗前2周開始撤除阿霉素培養，因而，該細胞在2μg/ml阿霉素作用下是不會死亡的，只是細胞的生長速度減慢了，細胞并未發生凋亡。聯用PI-103后，盡管K562/A02細胞的生長受抑率僅僅是兩藥的疊加，但細胞凋亡是否有增加，尚不明確，換用流式細胞術檢測細胞凋亡率也許有助于得出更確切的結論。其次，是否有其他耐藥機制的參與，拮抗了細胞內阿霉素濃度提高所致的殺細胞效應，尚有待進一步的研究。第三，與K562/A02細胞的特性有關。Kojima等[7]發現，在野生型P53存在的白血病細胞中，PI-103與阿霉素有協同作用，而在P53突變的白血病細胞，則無協同效果。以往研究顯示，K562細胞存在P53突變，因而，PI-103和阿霉素在K562及其耐藥株K562/A02中無協同殺傷白血病細胞的作用。然而，多數白血病原代細胞不存在P53突變。因而，體內應用于病人時，PI-103可能會與阿霉素產生協同效應。
        總之，在體外，PI-103具有抗白血病細胞作用，對敏感和耐藥細胞同樣有效；它能增加細胞內阿霉素濃度，增加細胞對阿霉素的敏感性。雙效PI3K/AKT/mTOR抑制劑是一種有良好應用前景的藥物，對PI-103的深入研究，必將為開發研制新的雙效PI3K/AKT/mTOR抑制劑奠定堅實的基礎。
參 考 文 獻
[1]Luan FJ. [Establishment of the multidrug-resistant cell line K562/A02 and its drug-resistant properties]. Zhonghua zhong liu za zhi [Chinese journal of oncology]. 1993 Mar;15(2):101-3.
[2]Lopez-Fauqued M, Gil R, Grueso J, Hernandez-Losa J, Pujol A, Moline T, et al. The dual PI3K/mTOR inhibitor PI-103 promotes immunosuppression, in vivo tumor growth and increases survival of sorafenib-treated melanoma cells. International journal of cancer.  Apr 1;126(7):1549-61.
[3]Zou ZQ, Zhang XH, Wang F, Shen QJ, Xu J, Zhang LN, et al. A novel dual PI3Kalpha/mTOR inhibitor PI-103 with high antitumor activity in non-small cell lung cancer cells. International journal of molecular medicine. 2009 Jul;24(1):97-101.
[4]Schwab J, Antonescu C, Boland P, Healey J, Rosenberg A, Nielsen P, et al. Combination of PI3K/mTOR inhibition demonstrates efficacy in human chordoma. Anticancer research. 2009 Jun;29(6):1867-71.
[5]Martelli AM, Tazzari PL, Evangelisti C, Chiarini F, Blalock WL, Billi AM, et al. Targeting the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin module for acute myelogenous leukemia therapy: from bench to bedside. Current medicinal chemistry. 2007;14(19):2009-23.
[6]Tazzari PL, Cappellini A, Ricci F, Evangelisti C, Papa V, Grafone T, et al. Multidrug resistance-associated protein 1 expression is under the control of the phosphoinositide 3 kinase/Akt signal transduction network in human acute myelogenous leukemia blasts. Leukemia. 2007 Mar;21(3):427-38.
[7]Kojima K, Shimanuki M, Shikami M, Samudio IJ, Ruvolo V, Corn P, et al. The dual PI3 kinase/mTOR inhibitor PI-103 prevents p53 induction by Mdm2 inhibition but enhances p53-mediated mitochondrial apoptosis in p53 wild-type AML. Leukemia. 2008 Sep;22(9):1728-36.

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