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益氣消積方含藥血清對人胃癌NKN?28細胞株的作用
【關鍵詞】 胃癌; 血清; 腫瘤; 大鼠益氣消積方（Yiqi Xiaoji Recipe, YQXJR）是根據上海交通大學醫學院瑞金醫院中醫科主任沈小珩教授十多年致力于腫瘤研究的臨床經驗，并結合臨床實踐總結而出的新一代抗癌復方，臨床觀察對胃癌有較好的治療作用。本次實驗采用益氣消積方含藥血清，溫育體外培養的人胃癌NKN?28細胞，通過甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法檢測細胞增殖抑制作用，研究該方對體外培養的人胃癌NKN?28細胞生長的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗材料 SD大鼠50只，雄性，清潔級動物，體質量（250±30）g，由上海交通大學醫學院瑞金醫院動物房提供；人胃癌高分化腺癌細胞系NKN?28細胞，由上海瑞金醫院消化內科實驗室負責孵育提供；益氣消積方主要由黃芪、全蝎和白花蛇舌草等組成，生藥購自上海瑞金醫院中藥房，由中藥房代煎，上海中藥研究所實驗室濃縮而成，含生藥量為2.8 g/ml；RPMI?1640培養液、胰蛋白酶為Gibco公司分裝,批號31800?022；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所產品；MTT，上海實生細胞生物技術有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO），美國Fisher科學世界公司香港分公司產品；TE2000?U多功能倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司產品；MK3酶標儀，芬蘭雷勃公司產品。
1.2 益氣消積方含藥血清的制備
1.2.1 含藥血清的制備 選用正常SD大鼠36只，禁食12 h后，予益氣消積方煎液灌胃給藥。大鼠分為3個劑量組（每組12只）分別給藥，給藥劑量分別為，低劑量組1.17 g/kg，中劑量組5.85 g/kg，高劑量組11.7 g/kg，分別相當于60 kg成日用量的同倍、5倍、10倍。給藥方式為每天分2次給藥，即采用一次及二次重復（2 h后相同劑量重復給藥一次）給藥方法。連續灌胃3 d，第3天第1次給藥2 h后再給藥1次，1 h后，乙醚麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，靜置2 h以上，1 500 r/min，離心15 min，10 min后取血清，按灌胃濃度分別混合，56 ℃，30 min滅活，分裝，－20 ℃冰箱保存備用［1］。
1.2.2 大鼠正常血清制備 對照組SD大鼠14只用生理鹽水灌胃，每只2 ml/次，2次/d，連續3 d。于第3天第1次灌胃2 h后再灌胃1次，1 h后，乙醚麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，靜置2 h以上，1 500 r/min，離心15 min，10 min后取血清，56 ℃，30 min滅活，分裝，－20 ℃冰箱保存備用。
1.3 細胞培養 NKN?28細胞株常規培養于含10％新生牛血清的RPMI?1640培養基（含硫酸慶大霉素0.025 U/ml）中，于37 ℃、5％ CO2孵育箱中進行連續培養［2］。
1.4 倒置顯微鏡下細胞生長狀態觀察 上述培養細胞，去掉培養液，分別加入以上各組血清，在CO2培養箱中繼續培養24 h和48 h，將培養瓶在倒置顯微鏡下作生長狀態觀察。
1.5 細胞抑制率的檢測 取濃度為1×105個/ml處于對數生長期貼壁生長的人胃癌NKN?28細胞，按1×104個細胞/孔的濃度接種于96孔培養板（200 μl/孔），放入37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h后取出，吸棄培養板上清后加入高、中、低濃度含藥血清及空白血清，每種濃度設1/2、1/4、1/8、1/16四種不同比例，200 μl/孔，每種比例設6個復孔。放回培養箱中，使藥物與細胞共同孵育48 h和72 h。取出培養板，向每孔加入MTT 20 μl，繼續培養2 h后終止培養，小心吸去孔內上清，每孔加入DMSO 150 μl，再放回培養箱中培養30 min，使結晶物充分溶解之后，在酶聯免疫檢測儀570 nm處讀取各孔光密度值（即OD值）。抑瘤率（％）=（1－OD實驗組/OD對照組）×100［3］。
1.6 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件包進行數據分析，計量資料以x±s表示，組間比較用單因素方差分析和LSD檢驗。
2 結果
2.1 人胃癌NKN?28細胞生長狀況 倒置顯微鏡下，對照組的人胃癌NKN?28細胞可見貼壁生長，細胞形態呈梭形，胞漿均勻，細胞透明，相鄰細胞生長融合成片；而經含藥血清處理的各組細胞，24 h可見細胞由貼壁而脫落，至48 h脫落更明顯，脫落細胞懸浮于培養液中，細胞形態變圓或不規則，細胞變暗。比較含藥血清各組細胞生長狀況，以高劑量組含藥血清組作用48 h脫落最明顯。說明益氣消積方有抑制人胃癌NKN?28細胞生長的作用，呈現一定的時間濃度依賴性。
2.2 MTT檢測結果
2.2.1 48 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤作用 經單因素方差分析，四組48 h不同濃度不同比例含藥血清對人胃癌NKN?28細胞的抑瘤率差異有統計學意義（P＜0.01）。經LSD組間檢驗，在1/2、1/4血清比例時，高、中劑量組的抑瘤率均明顯高于空白血清組，差異有統計學意義（P＜0.01），低劑量組的抑瘤率略高于空白血清組，差異無統計學意義（P＞0.05）；在1/8血清比例時，高劑量組的抑瘤率高于空白血清組，差異有統計學意義（P＜0.01），中、低劑量組的抑瘤率略高于空白血清組，差異無統計學意義（P＞0.05）；在1/16血清比例時，高、中、低三個劑量組的抑瘤率略高于空白血清組，差異無統計學意義（P＞0.05）。同時1/2、1/4、1/8血清比例時，高劑量的抑瘤率明顯高于各低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）；1/16血清比例時，高劑量的抑瘤率略高于各低劑量組，差異無統計學意義（P＞0.05）。說明益氣消積方有抑制人胃癌NKN?28細胞增殖的作用，其抑制作用以高劑量組最佳。見表1。
2.2.2 72 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤率 經單因素方差分析，四組72 h不同濃度不同比例含藥血清對人胃癌NKN?28細胞的抑制率差異有統計學意義（P＜0.01）。經LSD組間檢驗，在各血清比例時，高劑量組的抑制率均高于空白血清組，差異有統計學意義（P＜0.01）。在1/2、1/4血清比例時，中劑量組的抑制率高于空白血清組，差異有統計學意義（P＜0.01）；在1/2血清比例時，低劑量組抑瘤率高于空白血清組，差異有統計學意義（P＜0.01）。在各血清比例時，高劑量組的抑瘤率均高于各低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.01）。說明益氣消積方有抑制人胃癌NKN?28細胞增殖的作用，且這種抑制作用隨著中藥濃度及時間的增加而有所提高。見表2。
表1 48 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤率（略）
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