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首烏愈癱片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
【摘要】 目的建立首烏愈癱片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法對(duì)首烏愈癱片中的決明子、槲寄生、海馬、淫羊藿進(jìn)行鑒別;采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。結(jié)果 選定的薄層色譜條件可鑒別制劑中決明子、槲寄生、海馬、淫羊藿;2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.052～0.260 μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 9，平均回收率為97.19%，RSD=1.63%。結(jié)論 本法簡(jiǎn)單可行，能快速準(zhǔn)確地對(duì)首烏愈癱片進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定，可較好地用于首烏愈癱片的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】 首烏愈癱片;二苯乙烯苷;大黃酚;齊墩果酸;淫羊藿苷;HPLC;TLC;質(zhì)量控制
Abstract:ObjectiveTo establish the standard for quality control of Shouwu Yutan tablets.Methods Semen Cassiae,Herba Visci,Hippocampus and Herba Epimedii were identified by TLC.The content of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbence-2-O-β-D-glucoside in Radix Polygoni Multiflori was determined by HPLC.Results Semen Cassiae,Herba Visci,Hippocampus and Herba Epimedii could be identified by TLC.It showed a good linear relationship in determining 2,3,5,4′ -tetrahydroxystilbence -2-O -β-D-glucoside at the range of 0.052~0.260 μg,r=0.999 9.The average recovery was 97.19%(RSD=1.63%).Conclusion This method is easy,feasible,accurate and can be used to control the quality of Shouwuyutan Tablets.
Key words:Shouwu Yutan tablets; 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbence-2-O-β-D-glucoside; chrysophanol; oleanolic acid ;icariin;HPLC; TLC; quality control
首烏愈癱片為中藥6類(lèi)新藥，目前正處于臨床前研究階段，其由制何首烏、決明子、槲寄生、海馬、淫羊藿5味中藥組成，具有滋補(bǔ)肝腎功能，主要用于肝腎陰虛型中風(fēng)病的恢復(fù)期治療。方中重用制何首烏為君藥，槲寄生、決明子共為臣藥，海馬、淫羊藿稍佐之，以圖治中風(fēng)病之根本。本試驗(yàn)參考國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《藥品注冊(cè)管理辦法》中的中藥、天然藥物注冊(cè)分類(lèi)及申報(bào)資料的要求,結(jié)合首烏愈癱片中主要成分的理化性質(zhì),采用薄層色譜法對(duì)方中決明子、槲寄生、海馬、淫羊藿進(jìn)行鑒別,采用高效液相色譜法對(duì)制何首烏所含的2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱(chēng)二苯乙烯苷)進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明本法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,可用于首烏愈癱片的質(zhì)量控制。
1儀器與試藥
1.1儀器
LC-2010A 型高效液相色譜儀(日本島津公司)，包括SPD-M10Avp 型檢測(cè)器、CLASS-VP 型色譜工作站;Shimadzu-C18 柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);AE-240 型電子天平(瑞士Mettler Toledo 公司);KQ-250E 型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司，250 W,40 kHz)，2、3 μL定量毛細(xì)管(美國(guó)Drummond Scientific 公司)。
1.2試藥二苯乙烯苷對(duì)照品(110844-200003)、大黃酚對(duì)照品(110796-200309)、淫羊藿苷對(duì)照品(110737-200312)、齊墩果酸對(duì)照品(110709-200304)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。制何首烏、決明子(炒)、槲寄生、淫羊藿購(gòu)自安徽亳州京苑康藥材公司，海馬購(gòu)自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定，均符合《中國(guó)藥典》要求。首烏愈癱片樣品3批(20030115、20030116、20030117)及缺決明子、槲寄生、海馬、淫羊藿陰性對(duì)照樣品各1批均為實(shí)驗(yàn)室自制。甲醇為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。
2方法與結(jié)果
2.1薄層鑒別
2.1.1決明子的鑒別[1-6]取本品5片，研細(xì)，稱(chēng)取1 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液洗滌3次，每次30 mL，堿液棄去，乙醚液揮干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺決明子陰性對(duì)照樣品1 g,同法制得缺決明子陰性對(duì)照樣品溶液。另取大黃酚對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的大黃酚對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法[7]試驗(yàn)，精密吸取上述供試品溶液、缺決明子陰性對(duì)照樣品溶液各3 μL及大黃酚對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(體積比8∶2∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。
2.1.2槲寄生的鑒別精密稱(chēng)取齊墩果酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺槲寄生陰性對(duì)照樣品1 g，按“2?1?1”項(xiàng)下方法操作，制得缺槲寄生陰性對(duì)照樣品溶液。按照薄層色譜法[7]試驗(yàn)，精密吸取“2?1?1”項(xiàng)下供試品溶液、缺槲寄生陰性對(duì)照樣品溶液各3 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮(體積比4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%(φ)的硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。[PSD161;S*2〗1.大黃酚對(duì)照品; 2～4.供試品; 5.陰性對(duì)照?qǐng)D1決明子TLC鑒別圖譜Figure 1TLC Chromatogram of Semen Cassiae in ShouwuYutan tablets[PSD162;S*2〗1.齊墩果酸對(duì)照品; 2～4.供試品; 5.陰性對(duì)照?qǐng)D2槲寄生TLC鑒別圖譜Figure 2TLC Chromatogram of Herba Visci in Shouwu Yutan tablets
2.1.3海馬的鑒別取三斑海馬藥材0.2 g，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至約2 mL，作為對(duì)照藥材溶液。取缺海馬陰性對(duì)照樣品1 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作，制得缺海馬陰性對(duì)照樣品溶液。按薄層色譜法[7]試驗(yàn)，精密吸取“2?1?1”項(xiàng)下供試品溶液、海馬對(duì)照藥材溶液、缺海馬陰性對(duì)照樣品溶液各6 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮(體積比4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%(φ)硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖3。
2.1.4淫羊藿的鑒別取“2.1.1”項(xiàng)下乙醚萃取后的水液，以乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，揮干，殘?jiān)右掖?0 mL使溶解，作為供試品溶液。另精密稱(chēng)取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加70%(φ)乙醇制成每1 mL含0.1 mg的淫羊藿苷對(duì)照品溶液。取缺淫羊藿陰性對(duì)照樣品1 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作，得缺淫羊藿陰性對(duì)照樣品溶液。按薄層色譜法[7]試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液、淫羊藿苷對(duì)照品溶液、缺淫羊藿陰性對(duì)照樣品溶液各0.5 μL，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以36%(φ)醋酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%(ρ)三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖4。[PSD163;S*2〗1.陰性對(duì)照; 2～4.供試品; 5.海馬對(duì)照藥材圖3海馬TLC鑒別圖譜Figure 3TLC Chromatogram of Hippocampus in Shouwu Yutan tablets [PSD164;S*2〗1.淫羊藿苷對(duì)照品; 2～4.供試品; 5.陰性對(duì)照?qǐng)D4淫羊藿TLC鑒別圖譜Figure 4TLC Chromatogram of Herba Epimedii in Shouwu Yutan tablets
2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取二苯乙烯苷對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成每1 mL含二苯乙烯苷0.25 mg的溶液，即得。
2.2.2供試品溶液的制備取本品5片，研細(xì)，稱(chēng)取0.2 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理20 min，取出，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失去的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。
2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例稱(chēng)取缺制何首烏的其他藥材適量，依照首烏愈癱片的制備工藝和供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。
2.2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-水(體積比35∶65)為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各0.5 μL注入液相色譜儀，理論板數(shù)按二苯乙烯苷計(jì)不得少于2 000，陰性對(duì)照溶液在與二苯乙烯苷相同保留時(shí)間的位置無(wú)色譜峰的出現(xiàn)，見(jiàn)圖5。 [PSD165〗1.二苯乙烯苷?qǐng)D5二苯乙烯苷對(duì)照品(A)、首烏愈癱片(B)和陰性對(duì)照(C)的HPLC圖譜Figure 5HPLC Chromatograms of reference substance(A),Shouwu Yutan tablets (B) and negative sample(C)
2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱(chēng)取80 ℃干燥至恒重的二苯乙烯苷對(duì)照品，加流動(dòng)相制成二苯乙烯苷質(zhì)量濃度為0.26 mg·mL-1的溶液，分別精密進(jìn)樣0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL。以二苯乙烯苷進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=4.196×106X+2?688×104，r=0.999 9。結(jié)果表明二苯乙烯苷進(jìn)樣量在0.052～0.260 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2.6精密度試驗(yàn)精密吸取質(zhì)量濃度為0?262 mg·mL-1的二苯乙烯苷對(duì)照品溶液0.5 μL，按“2.2.4”項(xiàng)下方法，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積并計(jì)算其RSD值。結(jié)果峰面積積分值平均值為568 986?2，RSD=0.68%(n=5)，表明儀器精密度良好。
2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液(批號(hào)20030115)，分別于0、4、8、16、24 h進(jìn)樣0.5 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算其RSD值。結(jié)果峰面積積分值平均值為491 551，RSD=0.88%(n=5)，表明樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.2.8重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)的首烏愈癱片樣品(批號(hào)20030115)5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果首烏愈癱片中二苯乙烯苷的平均含量為15.768 mg·片-1，RSD=1.71%(n=5)，表明該方法重復(fù)性良好。
2.2.9加樣回收率試驗(yàn)取已知二苯乙烯苷含量的樣品(批號(hào)20030115，二苯乙烯苷為15.768 mg·片-1)5份，每份約0.1 g，精密稱(chēng)定。分別精密加入二苯乙烯苷對(duì)照品甲醇溶液(二苯乙烯苷質(zhì)量濃度為0.410 mg·mL-1)各10 mL，再精密加入甲醇20 mL，超聲提取20 min，取出，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足失去的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用微孔濾膜(0?45 μm)濾過(guò)，分別精密進(jìn)樣0.5 μL，測(cè)得回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。表1加樣回收率試驗(yàn)
2.2.10樣品測(cè)定取首烏愈癱片樣品3批，按“2?2.2”項(xiàng)下方法處理后依法測(cè)定，計(jì)算樣品中二苯乙烯苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。表2樣品含量測(cè)定
3討論
3.1研究表明[1-6]，制何首烏與決明子所含的主要有效成分均為蒽醌類(lèi)化合物，決明子中所含蒽醌類(lèi)成分主要有大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、決明苷等;而制何首烏中主要含大黃素甲醚、大黃素等，不含大黃酚，故選擇對(duì)決明子中的大黃酚進(jìn)行鑒別。
3.2樣品采用甲醇提取、乙醚萃取后直接進(jìn)樣，結(jié)果樣品色譜中成分較多，干擾嚴(yán)重。先后嘗試用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%NaOH、1%Na2CO3、5%Na2CO3溶液進(jìn)行洗滌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%NaOH溶液可把大黃酚斑點(diǎn)一并洗去，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%Na2CO3溶液未去除干擾斑點(diǎn)，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%Na2CO3溶液可去除干擾，且樣品色譜中大黃酚斑點(diǎn)分離度好，故最終確定用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%Na2CO3溶液進(jìn)行洗滌。
3.3本試驗(yàn)對(duì)首烏愈癱片進(jìn)行的TLC鑒別斑點(diǎn)清晰無(wú)干擾、重現(xiàn)性好;采用HPLC法測(cè)定首烏愈癱片中二苯乙烯苷的含量,色譜峰分離效果良好、陰性對(duì)照無(wú)干擾,方法簡(jiǎn)便、可靠,可作為首烏愈癱片的質(zhì)量控制方法。
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