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發(fā)酵黃芪對BALB/C小鼠免疫功能及細(xì)胞因子的作用
【摘要】 目的研究發(fā)酵黃芪對小鼠免疫功能及細(xì)胞因子的影響。方法將小鼠隨機(jī)分成正常對照組、免疫抑制組、黃芪對照組和發(fā)酵黃芪低、中、高3個劑量組(劑量分別為 1，2， 5 g/kg)，飲水法喂飼小鼠，分別檢測以下指標(biāo): 小鼠胸腺和脾臟指數(shù)，淋巴細(xì)胞亞群，淋巴細(xì)胞增殖功能，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、IL-1、IL-2分泌。結(jié)果與免疫抑制對照組比較，發(fā)酵黃芪高、中劑量能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使CD3、CD4 、CD4/CD8明顯上調(diào)，促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，促進(jìn)白介素-1(IL-1)和白介素-2(IL-2)的產(chǎn)生(P均<0.05)。結(jié)論發(fā)酵黃芪能提高機(jī)體的免疫功能，其作用機(jī)制與激活T細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群、巨噬細(xì)胞功能及促進(jìn)細(xì)胞因子分泌有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 發(fā)酵黃芪; 免疫功能; 細(xì)胞因子; 小鼠
黃芪作為常用的補(bǔ)益類中藥，具有補(bǔ)氣固表及健脾利肺的功效。目前國內(nèi)外現(xiàn)代研究也已證實，黃芪含有多糖、苷類、生物堿、黃酮、微量元素及其氨基酸等成分具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用[1，2]。為了進(jìn)一步開發(fā)傳統(tǒng)的中藥劑型，研究發(fā)酵黃芪對小鼠免疫系統(tǒng)及功能的作用，對傳統(tǒng)中藥的二次開發(fā)提供理論及應(yīng)用的可行性依據(jù)。
1 材料與儀器
1.1 動物及細(xì)胞株健康BALB/C小鼠，雌雄各半7～8周齡，體質(zhì)量18 ～22 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供;C57BL/6，雌性體質(zhì)量18～20 g，一級動物，合格證號：冀醫(yī)動字第04035號。
1.2 藥品與試劑發(fā)酵黃芪由保定生物公司提供。RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清：美國GIBCO公司;胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、刀豆蛋白(ConA)為Sigma公司產(chǎn)品。 抗Thy1、2;抗LST4、抗 Lyt2美國FLUKA公司;環(huán)磷酰胺，上海第二制藥廠制造，(CycloPhosPhamide， CP)。二甲基亞砜(DMSO)購于上海化學(xué)試劑公司，其余試劑均為分析純。
1.3 儀器倒置顯微鏡(PM-10AD)，OLYMOUS日本。二氧化碳孵箱(TC2323，美國SHEL.LAB公司);酶標(biāo)儀(奧地利公司)。流式細(xì)胞儀，美國(FACS-420)。
2 方法
2.1 動物分組處理與給藥BALB/C小鼠隨機(jī)分成6組，每組7只動物，分別為生理鹽水對照組、環(huán)磷酰胺組、黃芪對照組、發(fā)酵黃芪小劑量組(1 g/kg)、中劑量組(2 g/kg)和高劑量組(5 g/kg)。黃芪組(1 g/kg)每天每只灌服0.5 ml，對照組灌服等量生理鹽水。環(huán)磷酰胺組ip給藥連續(xù)3 d造模。第8天各組頸椎脫臼處死小鼠，無菌取胸腺、脾測定。
2.2 臟器/體重比值測定實驗結(jié)束，稱質(zhì)量、胸腺重、脾重，取小鼠脾臟和胸腺稱重(濕重)，計算臟器指數(shù)(%)=臟器重量(g)/動物質(zhì)量(g)×100%。
2.3 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備及脾淋巴細(xì)胞活力的檢測采用MTT法[3] 小鼠分組與喂飼方法同上。 無菌取脾，經(jīng)過研磨200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾、經(jīng)常規(guī)裂解紅細(xì)胞，hank's液洗滌，離心2次，制得單細(xì)胞懸液，最后用含10%小牛血清RPMI-1640調(diào)細(xì)胞濃度5×106個/ml，接種于96孔板(100 μl/孔)，每組6個平行孔，每孔100 μl。37℃保濕培養(yǎng)68 h后，每孔加MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩5 min，紫色結(jié)晶完全溶解后于酶標(biāo)儀570 nm測定A值。
2.4 小鼠脾細(xì)胞亞群測定(流式細(xì)胞儀)[4]將6～8周齡、體質(zhì)量(20±2) g BALB/C雌性小鼠隨機(jī)分成6組，每組6只。無菌取小鼠胸腺細(xì)胞，4%甲醛固定，預(yù)冷PBS清洗，加入熒光標(biāo)記的CD3、CD4、CD8單克隆抗體50 μl，37 ℃ 30 min， 1 000 r/min離心10 min，加入熒光標(biāo)記的二抗工作液50 μl，37 ℃ 30 min，RNase消化，1ml碘化丙啶，每份樣本平均測定1×104個，分析相應(yīng)陽性細(xì)胞的含量。
2.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定[5] 小鼠分組與喂飼方法同上。按常規(guī)制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，置24孔培養(yǎng)板每孔加細(xì)胞懸液1 ml，5% CO2，37 ℃ 培養(yǎng)2 h，去上清液，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞，每孔加入0.1%中性紅生理鹽水液1ml，5% CO2，37℃培養(yǎng)2 h后，甩棄中性紅，并用預(yù)溫的BPS清洗未吸收的中性紅，吸水紙吸干，每孔加入細(xì)胞裂解液1 ml，靜置4 ℃ 過夜，用蒸餾水調(diào)零，于722分光光度計550 nm處測定吸光度A值，A值表示巨噬細(xì)胞吞噬功能的強(qiáng)弱。
2.6 腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的誘生及測定[5]小鼠分組與喂飼方法同上。將24孔板中貼壁純化的腹腔巨噬細(xì)胞各孔加入LPS(終濃度10 μg/ml)培養(yǎng)24 h后收獲上清，為誘生的IL-1粗品，-20 ℃ 保存待測。無菌取C57BL/6小鼠胸腺細(xì)胞，用10%小牛血清的RPMI-1640清洗并調(diào)細(xì)胞濃度1×107個/ml，加入96孔平底板，每孔0.1 ml，同時加入1∶4稀釋的誘生IL-1 0.1 ml，ConA(終濃度2.5 μg/ml)0.1 ml，每只鼠3個復(fù)孔，置5%CO2，37 ℃ 培養(yǎng)，用MTT比色法測定胸腺細(xì)胞的增殖。
2.7 脾細(xì)胞IL-2的誘生及測定[6]小鼠分組與喂飼方法同上。按常規(guī)制備脾細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為2.5×106個/ml，置24孔板孔/1ml，加入ConA(終濃度2.5 μg/ml)1 ml/孔，置5% CO2，37 ℃ 培養(yǎng)40 h后，收獲上清為誘生的IL-2，-20℃保存待測。常規(guī)制備正常小鼠脾細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度2.5×106個/ml，加入96孔平底板，每孔0.1 ml，加入1∶8稀釋的誘生IL-2 0.1 ml，每只鼠3個復(fù)孔，同時加入ConA(終濃度2.5 μg/ml)0.1ml，5 %CO2，37 ℃ 培養(yǎng)，用MTT比色法測定T淋巴細(xì)胞的增殖。
2.8 統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)用±s表示，統(tǒng)計分析采用SPSS11.5軟件進(jìn)行F檢驗和q檢驗。
3 結(jié)果
3.1 發(fā)酵黃芪對小鼠脾、胸腺指數(shù)的作用由表1可見，黃芪及發(fā)酵黃芪與環(huán)磷酰胺組相比較對胸腺重量影響不明顯，無顯著性差異(P>0.05)，但是與環(huán)磷酰胺對照組比較可以顯著提高脾臟指數(shù)，差異有顯著性，且有劑量依賴關(guān)系，發(fā)酵黃芪可顯著增加小鼠脾臟指數(shù)。表1 發(fā)酵黃芪對小鼠脾、胸腺指數(shù)的影響(±s)%
3.2 發(fā)酵黃芪對淋巴細(xì)胞增殖的影響由表 2 可見，發(fā)酵黃芪ig給藥在高劑量能明顯促進(jìn)小鼠T 淋巴細(xì)胞的增值，發(fā)酵黃芪高劑量組與環(huán)磷酰胺對照組相比均能明顯促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2 ，且有劑量反應(yīng)關(guān)系，能拮抗環(huán)磷酰胺對淋巴細(xì)胞的抑制作用。表2 發(fā)酵黃芪對小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖及T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響(±s)
3.3 發(fā)酵黃芪對小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的影響表3表明，發(fā)酵黃芪ig給藥在中、高劑量使CD3，CD4 ，CD4/CD8明顯上調(diào)，拮抗環(huán)磷酰胺對淋巴細(xì)胞亞群的抑制作用。表3 發(fā)酵黃芪對小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的影響(±s)
3.4 發(fā)酵黃芪對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及分泌細(xì)胞因子IL-1的影響表4表明，發(fā)酵黃芪ig給藥在中、高劑量能明顯促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增值及IL-1的分泌，能拮抗環(huán)磷酰胺對淋巴細(xì)胞的抑制作用。
4 討論
中藥對機(jī)體具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，黃芪及其有效提純物的免疫增強(qiáng)作用已被認(rèn)識，機(jī)體免疫功能的提高對機(jī)體的抗病能力、保證人體健康有重要作用。表4 發(fā)酵黃芪對環(huán)磷酰胺抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能及分泌IL-1的影響(±s)
胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，主要含有T 細(xì)胞、B 免疫細(xì)胞，在促有絲分裂劑的作用下會發(fā)生增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子的分泌。本試驗結(jié)果表明發(fā)酵黃芪能通過增加小鼠脾臟指數(shù)，促進(jìn)脾T淋巴細(xì)胞的增殖、活化，以及淋巴細(xì)胞亞群CD4+T細(xì)胞的上調(diào)、CD4+/CD8+比值上升，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2的分泌提高機(jī)體的特異性 免疫功能。本實驗發(fā)酵黃芪中、高劑量均能顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能及IL-1的分泌; 提高機(jī)體的非特異性免疫功能。IL-1主要來源于腹腔巨噬細(xì)胞，具有多種生物學(xué)作用，可以提高T細(xì)胞的增殖能力、促進(jìn)IL-2的合成和分泌而達(dá)到促進(jìn)免疫功能的作用。
總之，本次實驗結(jié)果提示傳統(tǒng)中藥的發(fā)酵處理，對小鼠的免疫功能不僅同樣有增強(qiáng)作用，且療效要強(qiáng)。采用生物發(fā)酵工藝加工炮制是傳統(tǒng)中藥的重要方法。目前我國來源于生藥的活性成分的生物轉(zhuǎn)化研究仍處于起步階段。這為中藥的二次開發(fā)提供一定的線索，值得進(jìn)一步的研究。
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