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褪黑素對(duì)PTZ致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響
【摘要】 目的 探討褪黑素對(duì)癲癇發(fā)作中細(xì)胞凋亡的影響。方法 將24只成年Wistar大鼠(180～230g)隨機(jī)分為NC組、PTZ組和MT組；PTZ組和MT組腹腔注射PTZ(60mg/kg)，誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，NC組腹腔注射等量生理鹽水。MT組按體重10mg/kg于注射PTZ之前20min、立即、后1h、后2h分別經(jīng)腹腔注射MT并觀察1h，PTZ組于相同時(shí)間注射生理鹽水。然后處死大鼠取腦，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)海馬神經(jīng)元Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 大鼠海馬神經(jīng)元Bax的改變：PTZ組明顯高于NC組，MT組明顯低于PTZ組，但高于NC組：大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2的改變：PTZ組明顯高于NC組，MT組明顯高于PTZ組，也高于NC組。結(jié)論 MT可以通過增強(qiáng)海馬神經(jīng)元Bcl-2的表達(dá)和降低Bax的表達(dá)而對(duì)抗癲癇中細(xì)胞的凋亡。【關(guān)鍵詞】 褪黑素；癲癇；戊四氮；Bax；Bcl-2
【Abstract】 Objective To explore the effect of melatonin on bcl-2 and bax of hippocampus in seizures rats induced by PTZ.Methods Twenty-four adults Wistar rats (180～230g) were randomly divided into three groups，NC group，PTZ group and MT group.A dose of PTZ(60mg/kg)was intraperitoneally injected into the rats of PTZ group and MT group and seizures was induced.The rats of NC group were administered with the same dose of normal saline.The rats of MT group were administered intraperitoneally with MT(10mg/kg)in 20 minute before injecting PTZ，at one time，1 and 2 hour after injection.Simultaneously the same dose of noraml saline was administered intraperitoneally on PTZ group.The rats were killed.To study the influence of MT on Bcl-2 and Bax immunoreactivity of neruon on hippocampus by using immunohistochemistry method.Results The number and optical density of Bax in hippocampus of PTZ group rats was higher than that of control group rats.The number and optical density of Bax in hippocampus of MT group rats was lower than that of PTZ group rats，was higher than that of control group rats；The number and optical density of Bcl-2 in hippocampus of PTZ gorup rats was higher than that of control group rats；The number and optical density of Bcl-2 in hippocampus of MT group rats was higher than that of PTZ group rats，was higher than that of control group rats.Conclusion Melatonin can resistant the apoptosis of hippocampus neruon by increased the expression of Bcl-2 and decreased the expression of Bax.
【Key words】 melatonin；seizure；pentylenetetrazole；bax；bcl-2
難治性癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病，發(fā)病機(jī)制至今沒有完全闡明，癲癇長期發(fā)作可能造成患者的智力和認(rèn)知發(fā)生改變，給和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在細(xì)胞凋亡，臨床癲癇病人也大多有海馬硬化存在。褪黑素(Melatonin，MT)是松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，它對(duì)人體的作用非常廣泛，近年研究發(fā)現(xiàn)它具有抗癲癇發(fā)作的報(bào)道［1］，但是它是否對(duì)癲癇發(fā)作后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡具有保護(hù)作用研究較少，本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察MT對(duì)戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)點(diǎn)燃大鼠海馬神經(jīng)元的Bcl-2和Bax的影響，借以了解其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，弄清它在治療癲癇中的進(jìn)一步作用機(jī)制。
1 與方法
1.1 材料 戊四氮及多聚甲醛均為Sigma公司產(chǎn)品，兔抗Bcl-2和Bax抗體購自北京中山試劑有限公司，Wistar大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)院動(dòng)物中心提供，羊抗兔抗體和DAB染色劑購自武漢博士德公司，褪黑素購自Alexis公司。
1.2 MT的制備 MT臨用前用無水乙醇溶解，再加生理鹽水配制，使乙醇的濃度為5%。
1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組 提前1w將大鼠飼養(yǎng)在12h光照(7：00～19：00)12h黑暗(19：00～7：00)安靜的，自由攝食進(jìn)水，24只健康雄性Wistar大鼠(320～380g)，隨機(jī)分為三組：一組為PTZ致癲癇組(PTZ組)；一組為MT干預(yù)組(MT組)；一組為正常對(duì)照組(NC組)，每組8只。PTZ組和MT組各8只，經(jīng)腹腔注入戊四氮(60mg/kg)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，并觀察行為學(xué)變化。MT組按體重10mg/kg于注射PTZ之前20min、注射后立即、后1h、后2h分別經(jīng)腹腔注射MT并觀察1h，PTZ組于相同時(shí)間注射等量含5%乙醇生理鹽水。然后，3組全部行心臟灌注固定取材。
1.4 灌注與取材 動(dòng)物先用10%的水合氯醛(0.3g/kg)腹腔注射麻醉，麻醉顯效后開胸在直視下將穿刺針自左心室插入主動(dòng)脈，自右心房剪口放血，先快速注入約150ml生理鹽水，然后滴注4%的多聚甲醛500ml，先快后慢，持續(xù)約1h，然后斷頭取腦，取出腦組織后修塊(含海馬)，將組織塊放入4%多聚甲醛中，2～4h后取出，放入20%的蔗糖中過夜，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，片厚4μm。
1.5 免疫組織化學(xué)方法(S-P法) 每只動(dòng)物取8張腦片，4張用于Bax，4張用于Bcl-2。具體步驟如下：(1)切片常規(guī)脫臘入水，PBS(pH 7.4)洗3次，每次3min。(2)高壓修復(fù)抗原，將切片浸入0.01M的枸櫞酸緩沖(pH 6.0)，高壓加熱，噴氣后2min。(3)每張切片滴加1滴過氧化酶阻斷溶液，37℃孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性。PBS洗3次，每次3min。(4)每張切片滴加1滴正常山羊血清封閉液，室溫孵育15min。(5)每張切片滴加1滴兔抗Bax和Bcl-2抗體，4℃過夜。(6)PBS洗三次，每次3～5min。(7)除去PBS液，每張切片滴加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，37℃孵育25min。PBS洗三次，每次3min。(8)除去PBS液，每張切片滴加2滴新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3min。(9)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS沖洗返藍(lán)。(10)切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。
1.6 圖像分析和數(shù)據(jù)處理 每只鼠取8張腦片，其斷面水平各鼠均相似，應(yīng)用HPIAS200彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。所有腦片均在同一放大倍數(shù)(×200)、同一光強(qiáng)度下分析。首先分析海馬內(nèi)Bax和Bcl-2平均陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后對(duì)所選腦區(qū)進(jìn)行陽性反應(yīng)細(xì)胞平均光密度測(cè)定。
1.7 學(xué)處理 結(jié)果用x±s表示。應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包分析(醫(yī)院統(tǒng)計(jì)室提供)。
2 結(jié)果
2.1 行為學(xué)變化 PTZ組在注射戊四氮后平均1.5min出現(xiàn)眨眼、動(dòng)須、節(jié)律性點(diǎn)頭、肢體抽搐、跌倒等，其中8只出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作。MT組在給后平均12min出現(xiàn)眨眼、動(dòng)須、節(jié)律性點(diǎn)頭、肢體抽搐、跌倒等表現(xiàn)，2只出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作，3只出現(xiàn)Ⅳ級(jí)發(fā)作，1只出現(xiàn)Ⅲ級(jí)發(fā)作，1只出現(xiàn)Ⅱ級(jí)發(fā)作。行為學(xué)的判斷標(biāo)準(zhǔn)按Racine法分為Ⅰ級(jí)：濕狗樣顫動(dòng)，面肌抽動(dòng)、咀嚼；Ⅱ級(jí)：節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：前肢陣攣；Ⅳ級(jí)：站立伴前肢陣攣；Ⅴ級(jí)：失平衡、傾倒、四肢抽動(dòng)、全身陣攣。
2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 海馬Bax和Bcl-2平均陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，胞體平均光密度值見表1和表2，免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱用平均光密度值表示，顏色越深數(shù)值越大。PTZ組Bax平均陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和胞體平均光密度明顯高于正常對(duì)照組，MT組明顯低于PTZ組，但高于NC組。PTZ組bcl-2平均陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和胞體平均光密度明顯高于NC組，VAP組明顯高于PTZ組，也高于NC組。
表1 海馬bax陽性細(xì)胞平均數(shù)目(N)和光密度(D)的比較 (x±s)
注：*P＜0.01 compared with NC group and PTZ group，
** P＜0.05 compared with NC group
表2 海馬bcl-2陽性細(xì)胞平均數(shù)目(N)和光密度(D)的比較 (x±s)
注：*P＜0.01 compared with NC group and PTZ group，
** P＜0.05 compared with NC group
3 討論
細(xì)胞凋亡是能量依賴的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活
化而致的“程序性細(xì)胞死亡”，是細(xì)胞的一種生理性、主動(dòng)性的“自覺自殺行為”。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中凋亡現(xiàn)象普遍存在。在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，神經(jīng)細(xì)胞的死亡也涉及凋亡機(jī)制，癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病，癲癇長期發(fā)作可以造成患者的智力和認(rèn)知功能發(fā)生改變，其中主要是與癲癇發(fā)作導(dǎo)致神經(jīng)元損害有關(guān)，因此臨床發(fā)現(xiàn)癲癇病人大多有海馬硬化存在。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作過程中造成的海馬神經(jīng)細(xì)胞的損害可誘導(dǎo)典型的凋亡現(xiàn)象發(fā)生［2］。細(xì)胞凋亡與許多基因表達(dá)密切相關(guān)，有促進(jìn)凋亡的基因，如Bax；也有某些基因的表達(dá)可使細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)如Bcl-2。Bcl-2可以與Bax結(jié)合形成Bcl-2/Bax異二聚體，阻止Bax插入線粒體外膜，保護(hù)線粒體電勢(shì)梯度，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的自穩(wěn)狀態(tài)和氧化還原狀態(tài)等多方面來抑制凋亡［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)陽性率明顯升高，而正常對(duì)照組僅有少量表達(dá)，說明癲癇發(fā)作可以激發(fā)內(nèi)源性的抗凋亡機(jī)制，但是這種保護(hù)機(jī)制是有限的，長期癲癇發(fā)作必將導(dǎo)致大量細(xì)胞的死亡，海馬硬化。因此探討有效的抗凋亡機(jī)制在保護(hù)癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元的死亡，提高患者的生活質(zhì)量，減輕家庭和的負(fù)擔(dān)具有重要的意義。
褪黑素是松果體腺分泌的一種激素，人體的褪黑素主要來源于松果體腺的分泌。此外，視網(wǎng)膜及胃腸道等組織也可合成褪黑素。其生理作用是調(diào)節(jié)季節(jié)性節(jié)律和晝夜節(jié)律，此外它還具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、抗抑郁、抗驚厥、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、延緩衰老及調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)的生長發(fā)育等多種生理功能。目前，褪黑素對(duì)腫瘤、老年性疾病、心血管疾病和癲癇等的作用機(jī)理研究，已成為科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)。Reiter等［4］研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以明顯抑制海仁酸所誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作；我們的實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)褪黑素可以明顯減輕戊四氮所誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作，使發(fā)作的程度減輕，發(fā)作的時(shí)間縮短。因此褪黑素可以作為一個(gè)潛在的抗癲癇物。并且我們的研究還發(fā)現(xiàn)，它還可以誘導(dǎo)Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax蛋白的表達(dá)，使Bcl-2/Bax的比值升高，穩(wěn)定線粒體膜，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。其上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax表達(dá)的具體機(jī)制不是很清楚，可能與以下因素有關(guān)：(1)MT具有高效的自由基清除能力，可清除體內(nèi)多種自由基，從而抑制自由基所誘導(dǎo)的Bax的上調(diào)表達(dá)［5］。(2)褪黑素能夠抑制MDA的產(chǎn)生，減輕氧化損傷所誘導(dǎo)的Bax的上調(diào)表達(dá)。(3)抑制NF-κB的表達(dá)，從而抑制Bax的上調(diào)表達(dá)［6］。(4)褪黑素可以使細(xì)胞內(nèi)的GABA的濃度升高，興奮性氨基酸(谷氨酸)的濃度降低，使Bcl-2的表達(dá)升高。(5)阻止Ca2+通道，抑制線粒體內(nèi)Ca2+超載所誘導(dǎo)的Bax的表達(dá)增加所觸發(fā)的細(xì)胞凋亡。
總之，褪黑素作為一個(gè)潛在的抗癲癇藥物，不僅能夠控制癇性發(fā)作，它還可以通過多種途徑抑制細(xì)胞的凋亡，減輕癲癇發(fā)作所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。
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