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反相高效液相色譜法測定人血漿中艾司西酞普蘭的濃度
【摘要】 目的 建立測定人血漿中艾司西酞普蘭濃度的HPLC?FLD法。方法 以DiamonsilTM C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，流動相為乙腈?0.03 mol·L-1醋酸銨(體積比45∶55，調(diào)pH=6.0)，流速為0.8 mL·min-1，激發(fā)波長：235 nm，發(fā)射波長307 nm，以正己烷?異戊醇(體積比95∶5)為提取劑。結(jié)果 艾司西酞普蘭的高(25 μg·L-1)、中(10 μg·L-1)、低(1.5 μg·L-1)3個濃度的平均回收率分別為95.29%、97.01%和97.22%，日內(nèi)(n=5)、日間(n=3)RSD均小于15%;分析方法的最低定量限為0.5 μg·L-1，線性范圍為0.5～50 μg·L-1,回歸方程為ρ=20.93A-0.015，r=0.999 9(n=7)。結(jié)論 該方法靈敏、準確、簡單、快速，可用于臨床血濃監(jiān)測和藥動學研究。
【關(guān)鍵詞】 艾司西酞普蘭;血藥濃度;反相高效液相色譜法
Abstract:Objective To set up an RP?HPLC method for content determination of escitalopram in human plasma.Methods Escitalopram was extracted with hexane?isoamyl alcohol. The residues were analyzed on an RP?HPLC column (Diamonsil C18, 5 μm, 4.6 mm×250 mm) using a mobile phase consisting of acetonitrile?0.03 mol·L-1 NH4Ac (45∶55，pH6.0). The fluorimetric excitation and emission wavelength was 235 and 307 nm, respectively.Results The average recoveries of three concentrations of escitalopram(25,10, 1.5 μg·L-1) were 95.29%, 97.01% and 97.22%, respectively. Inter? (n=3) and intra?day(n=5) assay RSD were less than 15%. The calibration curve was linear over the range of 0.5-50 μg·L-1 ( r = 0.999 9, n=7)and the limit of quantitation for escitalopram was 0.5 μg·L-1. Conclusion The method is sensitive, accurate, precise and reliable for clinical monitoring of plasma escitalopram.
Key words:escitalopram;plasma concentration;RP?HPLC
艾司西酞普蘭(escitalopram，ETP)是新一代的抗抑郁藥物，其對5?羥色胺重吸收抑制劑的相對選擇性在同類藥物中最高，能有效抑制5?羥色胺的再攝取，具有很強的抗抑郁作用。目前該藥由西安楊森制藥股份有限公司首次在國內(nèi)上市。其檢測方法國外采用高效液相色譜法[1-2]和LC?MS檢測法[3]。為便于進行血藥濃度監(jiān)測和藥動學研究，本文參照文獻[4]建立了以度洛西汀為內(nèi)標的測定人血漿中艾司西酞普蘭濃度的HPLC?FLD法。
1、儀器與試藥
1.1儀器
Agilent1100 HPLC儀配熒光檢測器G1321A，G1313A自動進樣器，G1311A自動調(diào)配泵，G1316A可調(diào)柱溫恒溫箱，Agilent色譜化學工作站(美國惠普);旋渦混合器(原上海醫(yī)科大學儀器廠);電子天平(瑞士SARTORIUS);MICRO12?24高速離心機(美國);MMM?GROUP真空干燥箱(德國)。
1.2藥品和試劑
草酸艾司西酞普蘭對照品(西安楊森制藥有限公司，批號：050608，質(zhì)量分數(shù)>99.5%)，內(nèi)標物為度洛西汀(美國禮來公司，批號：050621，質(zhì)量分數(shù)>99.8%)。乙腈(色譜純，迪馬公司)，水為超純水，其余均為分析純。
1.3對照品和內(nèi)標溶液
精密稱取草酸艾司西酞普蘭適量(含艾司西酞普蘭10.0 mg)加乙腈溶解并定容至10 mL，于冰箱4 ℃避光保存。臨用時用乙腈?水(體積比50∶50)稀釋成所需濃度的艾司西酞普蘭對照品溶液。度洛西汀濃度為10 mg·L-1的乙腈溶液。
2、方法與結(jié)果
2.1色譜條件
DiamonsilTM C18反相柱為色譜柱(迪馬公司，4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流動相為乙腈?0.03 mol·L-1 醋酸銨(體積比46∶54)，用甲酸調(diào)pH=6.0)，流速0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃;激發(fā)波長：235 nm，發(fā)射波長307 nm。艾司西酞普蘭和度洛西汀的保留時間分別為6.3 min和8.5 min。見圖1。
圖1艾司西酞普蘭HPLC色譜圖 略
2.2樣品處理
取1 mL含藥血漿加至10 mL錐形玻璃離心管中，加入10 mg·L-1的度洛西汀溶液50 μL，快速振蕩5 s，加入0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液0.2 mL，振蕩5 s。加入3 mL正己烷?異戊醇(體積比95∶5)密塞，旋轉(zhuǎn)振蕩30 s，3 000 r·min-1離心10 min，吸取有機層轉(zhuǎn)入5 mL錐形玻璃離心管內(nèi)，30 ℃真空干燥至干。進樣前加入0.1 mL乙腈?水(體積比50∶50)溶解，快速振蕩10 s溶解殘渣，吸取10 μL進樣。
2.3標準曲線的制備
取空白血漿1 mL 8份，分別加入0、10、20、50、100、200、500、1 000 μg·L-1濃度的艾司西酞普蘭對照品溶液，振蕩5 s，使血漿藥品質(zhì)量濃度相當于0、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg·L-1，然后按血樣處理方法處理。經(jīng)HPLC分析，測得ETP峰面積與內(nèi)標峰面積之比(A)作橫坐標，以血漿ETP質(zhì)量濃度(ρ)為縱坐標，得到0.5.～50 μg·L-1范圍的血漿ETP濃度標準曲線。直線方程為：ρ=20.93A-0.015，r=0.999 9。當RS/N=3時,最低檢測濃度為0.5 μg·L-1。分別取5個不同來源空白血漿1 mL，分別加入10 μg·L-1的艾司西酞普蘭乙腈溶液50 μL，按照“2.2”項操作，測得結(jié)果為(0.54±0.03) μg·L-1，RSD為4.75%。
2.4回收率及精密度試驗
取高、中、低3種濃度(25、10、1.5 μg·L-1)制作提取前和提取后的2組樣品，經(jīng)色譜分析，以峰面積比較,得到的提取回收率均大于90%。按“2.3”項下方法分別配制高、中、低3種濃度樣品，在1 d內(nèi)和分散于2周內(nèi)測定其濃度，計算日內(nèi)、日間誤差及相對回收率。結(jié)果見表1。
2.5血漿樣品的穩(wěn)定性試驗
按“2.3”項下方法分別配制高、中、低3種濃度(25、10、1.5 μg·L-1)的3組血漿樣品,分別在室溫(放置6、12、24 h )、長期凍存(-20 ℃凍存1、2、3 星期)和凍融(1、2、3次)條件下分別進行色譜測定，結(jié)果見表2。
表1回收率與日內(nèi)、日間精密度 略
表2穩(wěn)定性考察 略
2.6質(zhì)控樣品的監(jiān)控
按“2.3”項下方法分別配制高、中、低3種濃度(25、10、1.5 μg·L-1)置-20 ℃凍存，備用，此即為質(zhì)控樣品。每天檢測血樣品前須按照“2.3”項方法制作隨行標準曲線及檢測高、中、低3種濃度雙份質(zhì)控樣品，如果相對回收率均在85%～115%(低濃度可在80%至120%之內(nèi))內(nèi)時，即可認為儀器檢測正常，否則須檢查整個操作過程以及儀器原因。
2.7臨床檢測實例
40例抑郁癥患者，男25例，女15例，年齡19～73歲，平均(23±11)歲，連續(xù)服藥14 d血藥濃度達穩(wěn)態(tài)后測定艾司西酞普蘭濃度，結(jié)果：15例口服5 mg·d-1，平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度為(15.14±8.00) μg·L-1;22例口服10 mg·d-1，平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度為(19.08±8.81) μg·L-1;3例口服15 mg·d-1，平均血藥濃度為(62.08±23.74) μg·L-1。
3、討 論
3.1測定波長的選擇
在激發(fā)波長220～400 nm和吸收波長300～500 nm范圍進行掃描，發(fā)現(xiàn)最大激發(fā)波長為235 nm，最大吸收波長為307 nm，與文獻[4]報道的236 nm和306 nm相似。
3.2流動相的選擇
曾試用乙腈?0.03 mol·L-1醋酸銨為流動相，按不同配比均發(fā)現(xiàn)艾司西酞普蘭峰拖尾，峰形對稱性不理想;用甲酸調(diào)pH值為6，乙腈?0.03 mol·L-1醋酸銨的體積比為45∶55時，峰形對稱，半峰寬窄;設(shè)定流速為0.8 mL·min-1時，柱溫為30 ℃時，出峰時間理想，檢測時間比文獻[4]的時間縮短5 min，故采用此色譜系統(tǒng)。
3.3提取溶劑的選擇
分別曾試用乙醚、正己烷、醋酸乙酯、乙腈、氯仿和正己烷?異戊醇為提取劑，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)在正己烷?異戊醇(體積比95∶5)中的提取率最高，故采用此混合溶劑作為提取劑。
3.4 內(nèi)標物的選擇
經(jīng)過對β?萘酚、鹽酸普萘洛爾、替米沙坦、度洛西汀等物質(zhì)或藥物的比較發(fā)現(xiàn)，替米沙坦與艾司西酞普蘭色譜峰分不開，β?萘酚和鹽酸普萘洛爾相離太遠，均不是理想的內(nèi)標物，而度洛西汀與艾司西酞普蘭提取條件相似，且色譜峰分得開，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾，故選擇度洛西汀為內(nèi)標物。
本文方法操作簡單、快速，檢測結(jié)果準確、靈敏度高、重復性好，檢測定量限為0.5 μg·L-1，低于文獻[5]報道的1.3 μg·L-1，可作為臨床常規(guī)艾司西酞普蘭的血濃監(jiān)測及其藥動學研究的方法。
【參考文獻】
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citalopram in pharmaceutical preparations and spiked human plasma using organized media[J]. J AOAC Int,2006,89(5):1288.
[3] SMYTH W F, LESLIE J C, MCCLEAN S, et al. The
characterisation of selected antidepressant drugs using electrospray ionisation with ion trap mass spectrometry and with quadrupole time-of-flight mass spectrometry and their determination by high-performance liquid chromatography/electrospray ionisation tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20(11):1637.
[4] 溫預關(guān)，馬崔，趙振環(huán)，等.氫溴酸西酞普蘭片的人體相對生物利用度[J].中國臨床藥學雜志，2006，15(1)：43.
[5] 劉曉，張相林，李凱鵬，等.高效液相色譜-熒光法測定人血漿中西酞普蘭含量[J].藥物分析雜志，2005，25(10): 1186.
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