新型潛在肝損傷生物標(biāo)志物探究
藥物性肝損傷是指由藥物本身及其代謝產(chǎn)物或由于特殊體質(zhì)對藥物的超敏感性或耐受性降低所導(dǎo)致的肝臟功能異�；蚋闻K損傷，下面是小編搜集的一篇關(guān)于新型潛在肝損傷生物標(biāo)志物探究，歡迎閱讀借鑒。
越來越多的研究表明藥物性肝損傷(drug-inducedliverinjury,DILI)是急性或/和慢性肝臟疾病的重要誘因之一，在西方國家藥物性肝損傷是導(dǎo)致急性肝衰竭的首要因素;也是導(dǎo)致新藥申報(bào)未能獲批、經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市藥物最終撤市(如曲格列酮、曲伐沙星等)最普遍的原因之一。雖然DILI的發(fā)生率相對較低，約為1/10000至1/100000[1],但在DILI患者群中出現(xiàn)急性肝衰竭的風(fēng)險(xiǎn)和死亡率相對較高，相關(guān)數(shù)據(jù)表明由DILI引發(fā)最終需接受肝移植或?qū)е滤劳龅娜藬?shù)約占10%[2,3].另外，由于相關(guān)研究方法的限制，在藥物開發(fā)的臨床前研究及傳統(tǒng)臨床病理檢測中約有40%具有潛在肝毒性的化合物未能篩查出[4].因此，DILI不容小覷。
DILI是一類復(fù)雜的疾病，指由藥物本身或/及其代謝產(chǎn)物或由于特殊體質(zhì)對藥物的超敏感性或耐受性降低所導(dǎo)致的肝臟功能異�；蚋闻K損傷。根據(jù)其病理特征分為肝細(xì)胞型肝損傷、膽汁淤積型肝損傷及混合型肝損傷。用藥人群對肝毒性藥物的機(jī)體反應(yīng)可分為3個(gè)層次，即適應(yīng)、耐受和損傷發(fā)生[1].藥物在批準(zhǔn)上市前都需通過安全性評價(jià)檢測，因此對大多數(shù)人來說，治療劑量的藥物發(fā)生肝損傷風(fēng)險(xiǎn)很小，只有在某些肝毒性藥物(如對乙酰氨基酚)攝入過量、超過機(jī)體耐受能力時(shí)才會(huì)發(fā)生藥物劑量依賴性肝損傷。
而對于DILI易感人群，某些藥物在治療劑量下就可能引發(fā)特異質(zhì)型肝損傷。這類肝損傷在新藥開發(fā)前期研究中不易發(fā)現(xiàn)，與用藥劑量無關(guān)，并且在臨床用藥時(shí)采用常規(guī)肝損傷指標(biāo)難以預(yù)測。因此，尋找能預(yù)測特異質(zhì)型肝損傷的發(fā)生、識別易感人群的理想生物標(biāo)志物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
DILI初發(fā)癥狀一般特異性不高，大多與其他非藥源性肝臟疾病類似，同時(shí)其體征還具有一定的隱匿性，部分患者在發(fā)生DILI早期表現(xiàn)出輕微肝臟生化指標(biāo)異常甚至正常。因此，臨床上采用現(xiàn)行的檢測指標(biāo)難以對DILI及早診斷、明確病理類型，由此不利于進(jìn)行針對性地干預(yù)或及時(shí)停藥。雖然大部分輕微的肝損傷癥狀在停藥后可自行緩解，但一旦錯(cuò)過最佳診療時(shí)機(jī)，發(fā)生不可逆嚴(yán)重肝損傷，預(yù)后情況則不佳。另外，具有肝毒性的藥物其種類、結(jié)構(gòu)多樣，有研究表明單從藥物分子理化特性的角度不能找到有助于篩查藥物肝毒性信息[5,6].同時(shí)DILI分子機(jī)制的復(fù)雜性也增大了其檢測診斷難度。DILI的致病機(jī)制包括：藥物毒性代謝產(chǎn)物的生成、親電性化合物或活性氧引發(fā)氧化應(yīng)激和線粒體功能紊亂、藥物分子作為半抗原結(jié)合細(xì)胞蛋白，干擾細(xì)胞蛋白分子的正常生理功能或激活免疫系統(tǒng)引發(fā)特異質(zhì)藥物性肝損傷等。
總之，目前臨床上運(yùn)用傳統(tǒng)的肝損傷指標(biāo)來預(yù)測、診斷DILI的能力極為有限。為了能有效預(yù)測、及時(shí)診斷和治療DILI,尋找能在藥物開發(fā)和臨床相關(guān)性肝損傷發(fā)生發(fā)展早期能特異性評估發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物是亟待解決的問題。
1傳統(tǒng)肝損傷生物標(biāo)志物
Hy's法則是目前臨床上診斷DILI的金標(biāo)準(zhǔn)。包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素和總膽汁酸等在內(nèi)的傳統(tǒng)指標(biāo)已被廣泛應(yīng)用于臨床多年，這些指標(biāo)在對嚴(yán)重DILI的診斷方面具有重要的地位，但對于肝損傷的早期診斷、易感人群的識別區(qū)分等方面具有一定的局限性。
ALT、AST主要分布于肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷或壞死時(shí)，肝細(xì)胞完整性被破壞，ALT、AST被釋放入血，由此引起血漿中相應(yīng)含量上升，因此血漿中ALT、AST的升高反映了肝細(xì)胞膜破壞程度。血漿中ALP、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的含量通常用作膽汁淤積的診斷指標(biāo)，其異常升高直接反映了肝膽管膜的損害�？偰懠t素和總膽汁酸在循環(huán)血中的濃度取決于代謝酶的誘導(dǎo)作用和肝細(xì)胞內(nèi)生物合成活性，因此總膽紅素和總膽汁酸反映了肝功能的狀態(tài)，并非肝損傷的發(fā)生程度[7].因此，這些指標(biāo)實(shí)質(zhì)是根據(jù)肝細(xì)胞膜的完整性和肝功能異常來間接反映肝損傷，適用于在肝損傷發(fā)生之后對其進(jìn)行診斷檢測，而對肝損傷發(fā)生早期的預(yù)測較差。同時(shí)，部分傳統(tǒng)指標(biāo)在肝損傷診斷方面所具有的特異性不強(qiáng)。因?yàn)楣趋兰p傷也會(huì)導(dǎo)致血漿ALT、AST的增高[8],某些不涉及臨床相關(guān)肝損傷的藥物(如雙氯芬酸鈉)也有可能發(fā)生ALT一過性升高[9],另外肝臟具有一定的膽紅素清除潴留效應(yīng)，也有可能引起血漿膽紅素非病理性變化[7].
2新型潛在肝損傷生物標(biāo)志物
2.1血液樣本中的生物標(biāo)記
肝功能相關(guān)生化指標(biāo)檢測是目前臨床上用來診斷DILI最為有效的手段。
2.1.1蛋白質(zhì)分子當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)在生物標(biāo)志物的篩選方面應(yīng)用較多。Amacher等[10]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在大鼠模型上將蘋果酸脫氫酶(MDH)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、對氧磷酶(PON1)篩選作為與肝毒性相關(guān)的血清生物標(biāo)志物。Schomaker等[11]為檢驗(yàn)MDH、PNP、PON1、谷氨酸脫氫酶(GLDH)能否作為人體肝損傷指標(biāo)進(jìn)而開展臨床隊(duì)列研究。研究結(jié)果表明GLDH、MDH與ALT升高的水平具有高度相關(guān)性，并且不受年齡和性別因素的影響，對于肝損傷具有較高的預(yù)測效力，同時(shí)也具有良好的診斷價(jià)值。Antoine等[12]
選取對乙酰氨基酚導(dǎo)致肝損傷的首診患者進(jìn)行臨床研究，最終結(jié)果表明，相比于ALT,高遷移率族蛋白1(HMGB1)、凋亡型角蛋白18(K18)能及時(shí)靈敏地診斷對乙酰氨基酚過量引起的肝損傷。
另外，Bailey等[13]進(jìn)行的大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示α-谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(α-GSTA)、精氨酸酶1(ARG1)、4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HDP)用以監(jiān)測DILI具有比ALT更高的特異性和靈敏性，其中ARG1作為檢測指標(biāo)能提高對膽管損傷的檢測靈敏度，α-GSTA與ALT結(jié)合可以更靈敏地檢測肝細(xì)胞空泡樣變性的病理變化，HDP協(xié)同ALT用于診斷肝腫大具有更高的特異性。2012年，Bell等[14]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對DILI前瞻性研究機(jī)構(gòu)收集的相關(guān)人群血樣展開了一項(xiàng)系統(tǒng)性研究，發(fā)現(xiàn)不少蛋白質(zhì)分子可以在一定程度上表征DILI發(fā)生與否、發(fā)生程度、病理類型及預(yù)后狀態(tài)等。如DILI患者與健康人體內(nèi)apolipoproteinE水平有顯著性差異，fumarylacetoacetase可以用來鑒別肝細(xì)胞型DILI與混合型DILI等。
由此看來，這些蛋白質(zhì)分子作為生物標(biāo)志物都具有較大的潛力，但考慮到藥物肝毒性機(jī)制的復(fù)雜性，關(guān)于這類分子所具有的潛在臨床價(jià)值是否具有普適性還是僅適用于某種特定的肝毒性藥物等方面仍不明確，還需開展更加深入的研究。
2.1.2循環(huán)RNA循環(huán)血中含有的部分RNA來源于某些組織中細(xì)胞的裂解或壞死，具有一定的組織特異性。這些循環(huán)RNA大多與血中蛋白結(jié)合形成微囊或外泌體，避免了核糖核酸酶的降解作用，因此能比較穩(wěn)定地分布于血液中。Wang等[15]采用小鼠對乙酰氨基酚肝損傷模型對循環(huán)miRNA進(jìn)行了DILI方面的研究，發(fā)現(xiàn)miR-122、miR-192與肝損傷的發(fā)生密切相關(guān)。其中miR-122是一種具有較高肝臟特異性的miRNA,其在肝臟中的分布豐度約占體內(nèi)總含量的70%[16].隨后，Starkey等[17]對此開展了相應(yīng)的臨床試驗(yàn)，研究結(jié)果表明在miR-122、miR-192同樣適用于檢測人體對乙酰氨基酚肝損傷，并且miR-122在檢測靈敏性和特異性上更加優(yōu)于ALT.這一結(jié)論隨后在一項(xiàng)對乙酰氨基酚肝損傷首診患者的臨床研究[12]中再次得到證實(shí)。
外周血中也同樣存在著具有肝臟特異性的mRNA,Kudo等[18]研究發(fā)現(xiàn)通過檢測白蛋白Alb和結(jié)合珠蛋白haptoglobin的mRNA水平能更加靈敏地檢測肝臟纖維化的發(fā)生與發(fā)展。Wetmore等[19]證實(shí)在肝毒性藥物干預(yù)過程中，相關(guān)肝臟特異性mRNA的改變發(fā)生在血清轉(zhuǎn)氨酶和肝臟組織病理出現(xiàn)變化之前。
目前肝臟特異性mRNA的相關(guān)研究都是建立在大鼠等動(dòng)物模型上，后續(xù)還需足夠樣本量的臨床試驗(yàn)來對其臨床價(jià)值予以佐證。
2.1.3內(nèi)源性物質(zhì)(膽汁酸和脂肪酸)譜血漿或血清中的總膽汁酸水平可以表征肝臟排泄功能，現(xiàn)已作為檢測肝損傷的指標(biāo)之一應(yīng)用于臨床。近幾年相關(guān)文獻(xiàn)[20?23]報(bào)道體液中膽汁酸譜，即結(jié)合型膽汁酸含量、游離型膽汁酸含量或其相對比例的變化與肝損傷的發(fā)生有密切聯(lián)系。本課題組在前期研究[24]中發(fā)現(xiàn)，在抗結(jié)核藥物所致肝損傷引起血漿生化指標(biāo)和肝臟病理顯著改變之前，相關(guān)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)水平和活性已出現(xiàn)一定的改變。Yamazaki等[20]將多種肝毒性藥物作用于大鼠模型，發(fā)現(xiàn)在肝毒性藥物低劑量作用早期，在血清轉(zhuǎn)氨酶還未出現(xiàn)明顯改變的情況下，體液中的膽汁酸含量已顯著上升，并且隨著發(fā)生的肝毒性病理種類不同，其膽汁酸譜的變化也呈現(xiàn)出一定的差異，由此表明機(jī)體內(nèi)膽汁酸穩(wěn)態(tài)的破壞是發(fā)生DILI的早期事件之一。Ellinger-Ziegelbauer等[21]
研究指出大鼠模型體液中游離型膽汁酸的升高可指示為肝細(xì)胞型肝損傷，結(jié)合型膽汁酸的升高大多表明肝膽管損傷。若這一結(jié)論能在臨床試驗(yàn)方面得到進(jìn)一步的證實(shí)，膽汁酸譜將能作為具有肝損傷病理類型區(qū)分特性的生物標(biāo)志物。同時(shí)，某些膽汁酸還有可能作為肝損傷預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。Woolbright等[25]研究發(fā)現(xiàn)甘氨脫氧膽酸作為對乙酰氨基酚所致急性肝衰竭的預(yù)后指標(biāo)其評估效能較高，提示可用于預(yù)測進(jìn)展為急性肝衰竭患者的存活率。另外，體內(nèi)脂肪酸譜與DILI之間也存在著一定的聯(lián)系。有文獻(xiàn)[26]報(bào)道在伏立康唑用藥人群中，相比于未出現(xiàn)肝損傷的患者，發(fā)生肝損傷患者其血漿中脂肪酸含量發(fā)生了一系列變化。在檢測的12種脂肪酸中，發(fā)現(xiàn)有10種其含量都出現(xiàn)明顯增加，其中C14∶0、C16∶1t、C18∶3t、C20∶2、C20∶4這5種脂肪酸含量改變尤為顯著。由此，機(jī)體內(nèi)脂肪酸譜的相應(yīng)變化將有可能表征伏立康唑所致肝損傷的發(fā)生。
2.1.4相關(guān)基因型或基因多態(tài)性從根本上避免DILI,尤其是特異質(zhì)型肝損傷，最理想的情況是在用藥人群接觸具有潛在肝毒性藥物之前就能及時(shí)辨別DILI易感人群，從而對其選用其他安全性高的藥物。
個(gè)體化醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)，個(gè)體攜帶的某些特定基因在一定程度上已經(jīng)決定了相關(guān)藥物或化合物的代謝途徑及程度。因此不少研究團(tuán)體借助藥物基因組學(xué)技術(shù)試圖在該領(lǐng)域?qū)ふ揖哂辛己妙A(yù)測價(jià)值的理想生物標(biāo)志物。目前已發(fā)現(xiàn)一些與DILI易感性高度相關(guān)的特定基因。
先后有幾項(xiàng)研究[27?29]表明，除了年齡、營養(yǎng)狀態(tài)、性別、合并用藥等獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素外，具有282T/T、590A/A、857G/A或857A/A;NAT2*5B/5B或NAT2*6A/6A;GSTT1基因缺失純合子基因型的個(gè)體很有可能為抗結(jié)核藥物肝損傷的高風(fēng)險(xiǎn)人群，其中NAT2慢乙酰化基因型可能是異煙肼引起DILI的主要風(fēng)險(xiǎn)因素�？股仡愃幬镫m然常被用以短期給藥，但也出現(xiàn)了肝損傷的相關(guān)病例。研究[30?32]
發(fā)現(xiàn)分別篩查HLA-B*5701與HLAclassIISNPrs9274407基因型可以在一定程度上幫助識別氟氯西林、阿莫西林克拉維酸肝損傷易感人群。另外，膽酸鹽外排泵BSEP功能障礙易導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積，繼而引發(fā)肝損傷。Lang等[33]研究發(fā)現(xiàn)攜帶突變型BSEP基因的個(gè)體發(fā)生膽汁淤積型肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)明顯增大，如BSEP676位點(diǎn)由天冬氨酸突變?yōu)槔野彼�，與氟伐他汀鈉導(dǎo)致的肝損傷顯著相關(guān)，BSEP855位點(diǎn)由甘氨酸突變?yōu)榫彼�，與雌二醇引發(fā)的肝損傷高度相關(guān)。
截至目前，絕大部分研究都是選取血液樣本來尋找理想生物標(biāo)志物。從血液樣本中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)潛在標(biāo)志分子越來越多，研究手段和建立的檢測方法也日趨成熟，但發(fā)現(xiàn)與確定能應(yīng)用于臨床的新生物標(biāo)志物仍然面臨不少問題。血液樣本的采集必須由醫(yī)護(hù)人員協(xié)助，采樣的'次數(shù)、時(shí)間及采樣量受到一定的限制，同時(shí)也存在著來自醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的約束。其次，血液樣本中成分復(fù)雜，測定干擾因素多，研究所采用的相關(guān)組學(xué)分析或芯片技術(shù)成本較高。同時(shí)血樣中存在著多種降解轉(zhuǎn)化酶，在DILI發(fā)生早期，某些特異性和靈敏度高的指示分子發(fā)生酶解的可能性較大。更重要的一點(diǎn)是血液樣本量極為有限。若要增大研究結(jié)果的置信度，提高研究結(jié)果向臨床轉(zhuǎn)化的應(yīng)用價(jià)值，最根本的方法即為擴(kuò)大樣本量，開展前瞻性研究，而這一點(diǎn)目前受到多方面的限制。
2.2尿液樣本中的生物標(biāo)記
近年來不少研究致力于從尿液中尋找特異性較好的肝損傷生物標(biāo)記物。尿液中的成分及其含量與其在血液中的分布具有一定的相關(guān)性，相比于血液樣本，尿液中的蛋白豐度更低，樣品檢測的信噪比更小，因此更有利于標(biāo)志物的檢測。更為重要的是尿樣檢測具有無創(chuàng)性，這些特性使得尿液中生物標(biāo)志物具有較好的臨床價(jià)值。值得注意的是，尿液樣本的生成比血液樣本多一步腎臟的濾過排泄過程，因此在進(jìn)行尿液樣本中生物標(biāo)志物的研究過程中需將腎功能可能產(chǎn)生的影響考慮在內(nèi)[7].
當(dāng)前從尿液中發(fā)現(xiàn)潛在肝損傷生物標(biāo)志物的研究比較有限，主要圍繞蛋白質(zhì)分子展開。vanSwelm等[34]采用對乙酰氨基酚肝損傷小鼠模型對尿液樣本進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿樣中超氧化物歧化酶1(SOD1)、碳酸酐酶3(CA3)和鈣調(diào)蛋白(CaM)含量變化與對乙酰氨基酚所致肝損傷的發(fā)生高度相關(guān)。他們繼而收集對乙酰氨基酚中毒患者和健康人群尿樣對以上指標(biāo)進(jìn)行深入研究，結(jié)果顯示SOD1、CA3只有在對乙酰氨基酚中毒患者尿樣中才能檢測到，更為有趣的是，尿樣中CaM的濃度與肝損傷患者血漿中對乙酰氨基酚的藥物濃度高度相關(guān)(r=0.97;P<0.0001)，在ALT未出現(xiàn)明顯病理性升高的患者尿樣中CaM已呈現(xiàn)顯著性上升，由此CaM顯示出比ALT更高的靈敏度和預(yù)測效力。另外，該研究團(tuán)體還以長期服用甲氨蝶呤治療銀屑病的人群為研究對象，發(fā)現(xiàn)服用高劑量藥物的人群容易發(fā)生肝纖維化，其尿液中神經(jīng)鈣粘素N-cadherin、結(jié)合珠蛋白haptoglobin和轉(zhuǎn)鐵蛋白serotransferrin等水平與甲氨蝶呤所致肝纖維化相關(guān)[35].
從尿液樣本中發(fā)現(xiàn)的肝損傷潛在生物標(biāo)記分子已有部分進(jìn)入臨床研究階段，但目前仍存在不少問題[7]限制了其向臨床應(yīng)用方面的轉(zhuǎn)化。尿液中蛋白質(zhì)的組成易受到飲食、運(yùn)動(dòng)、疾病等多個(gè)因素的影響，因此生物標(biāo)志物候選分子必須具有足夠的特異性和穩(wěn)定性來便于檢測。另外，尿量的波動(dòng)范圍較大，水、鹽的攝入和流汗、腹瀉等都會(huì)引起尿量的改變，進(jìn)而導(dǎo)致尿液中蛋白質(zhì)分子濃度的變化，因此將相關(guān)分子濃度標(biāo)準(zhǔn)化是發(fā)揮這些特異性生物標(biāo)志物應(yīng)用價(jià)值的前提條件，因此制定尿液蛋白質(zhì)分子濃度標(biāo)準(zhǔn)化指南是該領(lǐng)域尚需解決的問題。
3總結(jié)
近10年來，在DILI生物標(biāo)志物研究領(lǐng)域已取得較大進(jìn)展，表1整合了部分潛在生物標(biāo)志物。理想的生物標(biāo)志物應(yīng)是在生物體受到嚴(yán)重?fù)p害之前，就能對嚴(yán)重毒性損傷提供早期警報(bào)，有助于從藥物代謝轉(zhuǎn)運(yùn)、機(jī)體免疫和炎癥相關(guān)因素等多個(gè)方面綜合評估DILI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)的肝損傷檢測指標(biāo)未能滿足這些要求，同時(shí)，新藥開發(fā)前期藥物安全性評價(jià)體內(nèi)體外研究模型與人體之間存在的差異以及尚未明確的特異質(zhì)型肝損傷致病機(jī)制都提示研究者應(yīng)盡快找到更為理想的生物標(biāo)志物，降低DILI造成的危害，保障用藥安全。要想盡快達(dá)到這一目標(biāo)，需要掌握更加充足的用藥信息，綜合臨床醫(yī)生提供的藥物不良反應(yīng)報(bào)告、藥物臨床試驗(yàn)所取得的相關(guān)信息、專業(yè)研究機(jī)構(gòu)、網(wǎng)站和數(shù)據(jù)庫(如LiverTox)資源，由多領(lǐng)域?qū)＜?藥物學(xué)家、毒理學(xué)家、臨床醫(yī)生等)協(xié)同推進(jìn)DILI研究，讓潛在生物標(biāo)志物盡早服務(wù)于藥物開發(fā)與臨床。
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