藥物對腎小球抑制作用的對比分析

藥物對腎小球抑制作用的對比分析

　　論文關鍵詞：腎小球 物 作用 對比

　　論文摘要：采用體外培養的人腎小球系膜細胞技術，觀察具有降逆泄濁、益氣活血功效的腎康注射液及苯那普利對ECM不同成分的影響。腎康注射液具有抑制ECM成分中纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)和Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)的作用，該抑制作用具有一定的量效關系。苯那普利對ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但不及腎康注射液作用明顯。結論，腎康注射液對ECM的抑制作用優于苯那普利。

　　近年來，隨著對腎小球硬化機制認識的不斷深入，腎小球系膜細胞(MC)、細胞外基質(ECM)及各種細胞因子在腎功能進行性減退過程中所起的作用倍受關注。抑制MC增殖，減少ECM的堆積，拮抗細胞因子的不良作用，已成為防治腎小球硬化，延緩CRF病情進展的重要環節。

　　一、對比研究使用的

　　選用的材料

　　1、腎組織來源系我校附屬醫院婦產科孕5月引產胎腎。

　　2、藥物與試劑腎康注射液(SKI)由大黃、丹參、紅花等組成，成都藥大學附屬醫院提供，每毫升含原生藥0.3g；苯那普利(Benayzepril)由瑞士諾華制藥有限公司生產，批號：012200；V型膠原酶、HEPES均系Sigma產品；RPMI 1640、胰蛋白酶、胰島素均為美國GIBCO產品；小鼠抗人單克隆FN抗體、兔抗人FN多抗、羊抗兔IgG-HRP均購于北京中山生物技術有限公司；LN、Col Ⅳ放射免疫分析試劑盒，均購于上海海研生物技術中心。

　　3、主要儀器CO2孵箱(TYPE4型)德國HERAEUS公司生產；倒置顯微鏡(TOKYO)日本OLYMPUS公司生產；潔凈工作臺(月壇牌)北京半導體設備一廠生產；酶標分析儀(MODEL2550)美國BTO-RAD公司生產；FT-613自動計數125 I放免測量儀，北京核儀器廠生產。

　　二、研究采用的方法

　　1、MC培養與鑒定無菌取胎腎，分離提取腎皮質小球組織，按照于力方等方法(1)取去掉包囊的單個腎小球進行原代和繼代培養，實驗中使用傳代5代的MC。培養的細胞經免疫病理鑒定證實為單純的MC，無上皮細胞、腎小管細胞及成纖維細胞污染。

　　2、分組及MC上清的收集吸取培養的第5代MC培養瓶中液體，加胰酶1ml，置孵箱(5%CO2、37℃)中消化3min，加10% FCS 1640終止液2ml，抽吸于離心管中，800rpm，離心3min，棄上清，加15% FCS 1640培養液于離心管中，吹打，混勻。用計數板計數后，傾入加樣槽中，用8導加樣槍，按每孔200μl，密度4000/孔鋪板。將96孔板按列從左至右依次分為空白對照組(簡稱組Ⅰ)、苯那普利組(簡稱組Ⅱ)、腎康注射液高濃度組1、2(簡稱組Ⅲ、組Ⅳ)、腎康注射液中濃度組1、2(簡稱組Ⅴ、組Ⅵ)、腎康注射液低濃度組1、2(簡稱組Ⅶ、組Ⅷ)，共8組(列)，每列6孔，待細胞貼壁24h后，每孔加無血清1640培養液200μl同步24h。除空白對照組外，其余各組分別依次加入苯那普利10－3mmol/L及腎康注射液100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml，待刺激48h后依次收集上清待測。

　　3、測定ECM中FN的含量用雙抗體夾心ELISA法，0.5mg/ml鼠 抗人FN抗體原液用包被緩沖液稀釋1000倍。取96孔板，50μl/孔鋪板，4℃過夜，甩去。用PBS－吐溫20洗滌液洗板3次，每次3min，間隔2min，控干。每孔加1%BSA封閉液100μl，37℃，1h后甩去，控干。依次按組各孔分別加入待測上清50μl，37℃，3h后甩去，洗板4次后，加兔抗人FN抗血清(原液用0.1% BSA·PBS1∶1000稀釋)50μl/孔，室溫放置60min。加HRP羊抗兔IgG(用0.1% BSA·PBS1∶1000稀釋)50μl/孔，室溫放置50min。再洗板4次后，每孔加入OPD顯色液50μl，預熱酶標儀，用2M H2SO4終止液50μl/孔終止，立即在492nm波長讀數，并記錄OD值。

　　4、ECM中LN、Col Ⅳ含量的放射免疫法(RIA)測定采用競爭法，將緩沖液稀釋10倍，分別將125 I－LN、抗LN血清、125 I－ColⅣ、抗ColⅣ血清及二抗用緩沖液稀釋，將待測上清分別與125 I－LN、125 I－ColⅣ及相應的抗血清混勻，4℃過夜反應，加二抗4℃反應60min，離心3500r/min 10min棄上清，125 I放射免疫測量儀計數。

　　5、學處理數據均采用SDAS軟件進行統計處理，結果用(±s)表示。

　　三、研究的結果

　　腎康注射液與苯那普利對ECM成分含量的影響，在對ECM中FN含量影響方面，腎康注射液組(Ⅲ～Ⅶ組)與空白對照組(Ⅰ組)相比，均有顯著性差異(P＜0.05～0.01)；說明腎康注射液除低濃度組2(Ⅷ組)外，其余各組對FN均有明顯的抑制作用，而且隨著濃度的遞增此作用更加明顯，并表現出一定的量效關系。實驗還發現腎康注射液即使在極小濃度時對ECM中LN及Col Ⅳ的含量也有明顯的抑制作用，該抑制作用也呈現出一定的量效關系。苯那普利組(Ⅱ組)在對FN、Col Ⅳ含量影響方面，與空白對照組相比也有顯著性差異(P＜0.01～0.05)；但對LN影響方面，兩者比較無顯著性差異(P＞0.05)；說明苯那普利對ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但對LN其抑制作用不明顯。另外，從表中還可看出，腎康注射液各濃度組(Ⅲ～Ⅷ組)與苯那普利組相比，在抑制LN方面也均有極顯著性差異(P＜0.01)；除腎康注射液低濃度組2(Ⅷ組)外，其余各組與苯那普利組相比，在抑制Col Ⅳ方面也有顯著性差異(P＜0.01～0.05)；腎康注射液高濃度組(Ⅲ組)與苯那普利組相比，在抑制FN方面也有顯著性差異(P＜0.05)；說明腎康注射液在抑制ECM中FN、LN、Col Ⅳ含量方面優于苯那普利。

　　四、討論

　　腎小球硬化時ECM的改變是近年來國內外腎臟病學者研究的熱點之一，ECM在腎小球內的蓄積，是腎小球硬化的主要特征性變化。

　　苯那普利是第四代血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)�，F已證實，腎臟具有獨立的腎素－血管緊張素系統(RAS)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是該系統最具有生物活性的因子。目前研究證實AngⅡ受體(ATR)至少有Ⅰ和Ⅱ兩種亞型，其中Ⅰ型受體(ATR1)意義最大。該受體分布在腎小球MC上，與AngⅡ、AngⅢ有高度的親和力。進一步的研究還發現ATR1占腎內ATR亞型分布的90%以上，Osborne等在10余年前就報道動脈內注射3H標記的AngⅡ，發現3H-Ang Ⅱ只結合在腎小球系膜區，而不與腎血管、腎小管等部位結合。用125 I-AngⅡ進一步實驗發現光鏡下125 I-AngⅡ位于腎小球上，電鏡下125 I-AngⅡ顆粒在MC漿中。血管緊張素轉化酶是RAS中最后一級酶促反應的關鍵酶，用ACEI能夠抑制AngⅡ的形成，可使循環和組織中的AngⅡ水平下降，且可直接降低腎內AngⅡ的生成量，從而對抗AngⅡ對腎臟的不良反應，減輕腎小球硬化的發生。大量的研究還證實，ACEI除減輕腎小球的高灌注和高濾過作用外，還可通過阻斷腎小球基底膜(GBM)上AngⅡ的特異作用的結合點，可使GBM固有的負電荷增多，并抑制GBM的進一步增厚，從而直接改善GBM的通透性。目前體內外動物實驗還證實，ACEI亦有抑制腎小球MC和系膜基質增生的作用，從而直接阻止腎小球硬化的形成。近年來，上已成功地將ACEI用于各類腎臟病的治療，發現在降低蛋白尿，阻止腎小球硬化方面具有一定的作用。

　　本實驗結果表明，腎康注射液對ECM中FN、LN、Col Ⅳ的含量具有明顯的降低作用，并呈現出一定的量效關系。苯那普利雖對FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但此抑制作用遠不及腎康注射液明顯。從而提示MC是腎康注射液發揮治療作用的重要靶細胞，減輕ECM的積聚可能是腎康注射液延緩腎小球硬化的重要作用機制之一。值得注意的是，苯那普利主要是通過抑制AngⅡ的形成，減輕其對腎臟的損害，從而在阻止腎小球硬化方面發揮著重要作用，而腎康注射液是否對AngⅡ的形成也有一定的抑制作用，值得進一步深入探討。

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