桿菌肽在水產品中殘留量測定的微生物方法
桿菌肽目前沒有純品，需檢測的標示物組分多，色譜和質譜不能準確地確定其全部殘留標示物，需要采用微生物法來測定其殘留情況，下面是小編為大家搜集整理的一篇相關論文范文，歡迎閱讀參考。
桿菌肽最早于1943年由美國哥倫比亞大學的Johnson從患者的脛骨創傷污染物中分離出的枯草桿菌(Bacillμs sabtilis)中發現的[1].它是一種多組分的多肽類抗生素，含有至少5種單獨的化學成分，主要成分為桿菌肽A和桿菌肽B,對革蘭氏陽性菌的抗菌作用很強，對于螺旋體、放線菌也有同樣作用[2].
目前桿菌肽(鋅桿菌肽和亞甲基水楊酸桿菌肽)在很多動物中常作為飼料添加劑使用[3-5],研究發現飼料中添加抗菌肽對吉富羅非魚具有明顯的促生長效果[6].抗菌肽還對水產養殖過程中常見病原菌-嗜水氣單胞菌、梅氏弧菌、遲鈍愛德華氏菌及溫和氣單胞菌均有較好的抑菌效果[7].但是如果使用得不科學，將導致藥物在水產品中殘留情況嚴重，對動物性食品安全帶來隱患，因此，需要有效的檢測方法來檢測其殘留量。目前動物性食品或者飼料中桿菌肽殘留量的測定方法主要有微生物法[8-9]、液相色譜法或色譜質譜聯用法[10-13].因為桿菌肽目前沒有純品，需檢測的標示物組分多，色譜和質譜不能準確地確定其全部殘留標示物，加上需反映出不同活性組分生物活性的差異，所以采用微生物法來測定其殘留情況。本研究擬建立一種桿菌肽在水產品可食性組織中殘留量測定的微生物方法，監測水產品可食性組織中桿菌肽的殘留量，以保證我國水產品中桿菌肽殘留達到安全限量。
1材料與方法
1.1材料
1)儀器與器皿。恒溫培養箱(DN0-9162BS-Ⅲ,新苗醫療器械公司)、超凈工作臺(Type A2,LA-BONCO)、壓力蒸汽滅菌鍋(BL-50A,博訊實業有限公司)、高速冷凍離心機(CR-21,himac)、旋轉蒸發儀(TRE2000E,予華儀器有限責任公司)、旋渦混合器(HQ-60-Ⅱ,北方同正)、振蕩器(SHZ-82,科興儀器廠)、超聲波清洗器(SK2210HP,上�？茖�)、電子天平(MP2002,舜宇恒平科學儀器有限公司)，不銹鋼牛津杯(高(10.0±0.1)mm,外徑(8.0±0.1)mm,內徑(6.0±0.1)mm)、游標卡尺(精確度0.02mm)、一次性培養皿(15mm×90mm)等。
2)藥物與試劑。桿菌肽標準品(含量76.0%,Dr.Ehrenstorfera)、其他藥物(硫酸鏈霉素、鹽酸土霉素、恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、氨卡青霉素、替米考星、乙酰甲喹、甲砜霉素)均為標準品，甲醇、甲酸、正己烷均為分析純，蒸餾水，1%pH 6.0磷酸鹽緩沖液(PBS)：磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g,加水定容至1 000mL,滅菌。
3)細菌與培養基。藤黃微球菌CMCC(B)28001-8a3、大腸桿菌CMCC(B)44109-9、枯草芽胞桿菌CMCC 63501-2a16均購自中國獸藥監察所，抗生素檢定培養基Ⅱ號(低pH)、LB瓊脂培養基、LB培養基均購自海博生物技術有限公司。
4)空白水產樣品。草魚、鰻鱺和對蝦購自本地水產品市場，檢測均無任何藥物殘留。
1.2方法
1)標準溶液配制。準確稱取0.010 0g(精確至0.000 1g)桿菌肽標準品，用PBS溶解并定容至100mL,制得100mg/L的標準儲備液，4℃避光儲存，不超過1個月。根據需要稀釋成不同質量濃度的標準工作液，即用即配。
2)菌種培養及菌液制備。選用藤黃微球菌為檢測菌種。將滅過菌的LB培養基加入菌種安瓿瓶，溶解后，取少量到LB培養基中，混勻，(36±1)℃培養24h,之后轉接至斜面培養基，培養16~18h,挑取少量菌落到LB培養基中，再培養24h,接種于LB瓊脂平皿中，培養24h,用生理鹽水洗下，調整至6×108cfu/mL(麥氏濁度2.0)備用。4℃保存不超過1周。
3)檢定平板的制備。冷卻滅過菌的抗生素檢定培養基Ⅱ號至50~55℃,加適量檢測菌液，混勻，取5mL至培養皿內，凝固。用1μg/mL桿菌肽標準工作液預測試該菌液濃度的平板，如果培養后所呈現的抑菌圈直徑大于10mm,則該菌液濃度下的平板可使用，否則需重新調整菌液濃度，再制成能有效檢定藥物的平板。
4)空白組織液制備。稱取10g空白勻漿好的水產品肌肉組織于50mL離心管中，加20mLPBS,置于振蕩器中中速振蕩30min,超聲10min,8000r/min離心5min,分離的上清液用1mol/LNaOH調節pH至6.0后，用0.22μm針頭式濾器除菌備用。
5)標準曲線的繪制。吸取一定量桿菌肽標準儲備液，用PBS稀釋成1、2、4、6、8、10μg/mL系列質量濃度，準備制作標準曲線。其中參考溶液為4μg/mL的稀釋液。同時用各水產品空白組織提取液來稀釋桿菌肽標準儲備液，得到1、2、4、6、8、10μg/mL系列質量濃度，制作桿菌肽在各基質中的標準曲線，參考溶液為4μg/mL PBS稀釋成的稀釋液。以上稀釋液均當日配制。放置6個牛津杯于檢定平板上，間隔加滿參考溶液和標準溶液。
4℃放置1h后于(36±1)℃培養10~12h,去掉牛津杯，精確測量各藥物所產生的抑菌圈直徑(精確到0.02mm)，最后用全部參考溶液抑菌圈直徑的平均值減去各平板參考溶液抑菌圈直徑平均值的差值，作為各自平板的校正值，校正其他標準溶液抑菌圈直徑的平均值。以上各組溶液質量濃度的對數與該組被修正后的抑菌圈數值做標準曲線，求出回歸方程。相關系數r應不小于0.99.重復測定5次。
6)樣品前處理。準確稱取勻漿好的肌肉試樣4g,加入提取液(甲醇和0.1%甲酸水溶液體積比為3∶7)10mL,渦旋30s,60℃加熱5min,超聲5min,8 000r/min離心5min,取上清液于另一離心管。重復提取1次，合并上清液，加入15mL甲醇飽和正己烷，渦旋30s,6 000r/min離心5min,棄去上層，重復1次。所得樣液于50℃旋蒸至干。加入1mL PBS復溶，過0.22μm濾膜，供檢測。濃縮后樣液濃度為組織濃度的4倍。
7)藥物最低檢測限的測定。稱取4g空白勻漿好的肌肉組織(草魚、鰻鱺、對蝦)，每種肌肉各4份，分別加入桿菌肽0.5、1.0、1.5、2.0μg,得到0.125、0.250、0.375、0.500μg/g 4個藥物添加量的試驗組，按樣品前處理方法進行樣品前處理，同時作空白對照，最后杯碟法測定。每個質量濃度重復測定3次。結果以產生明顯抑菌圈(一般抑菌圈直徑大于10mm,并且標準液參考質量濃度抑菌圈清晰可見)的最低質量濃度為藥物在組織內的最低檢測限。
8)藥物回收率的測定。稱取3份4g空白勻漿好的肌肉組織，分別加入桿菌肽2、6、10μg,使藥物在各組織樣品中的添加量分別為0.5、1.5、2.5μg/g.經樣品前處理方法處理后，樣液質量濃度為2、6、10μg/mL,同時杯碟法測定對應質量濃度的桿菌肽標準液(2、6、10μg/mL)。每個質量濃度重復3次。對照標準曲線，計算出各個樣品在處理后的質量濃度和相對應的標準液的質量濃度，其比值為桿菌肽的絕對回收率。
9)桿菌肽的特異性測定。同時制備3種細菌藤黃微球菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的檢測平板，平板制作方法同藤黃微球菌。使用制作的3種細菌檢測平皿分別單一檢測多肽類藥物桿菌肽和其他類常用水產藥物的抑菌效果。重復3次。
10)杯碟法測定。定量檢測，置6個牛津杯于檢測平板內，間隔加入樣液和4μg/mL桿菌肽標準液，(36±1)℃培養(10±2)h;定性檢測，置4個牛津杯于檢測平板內，對角加樣液，余下2個牛津杯分別加2μg/mL和4μg/mL桿菌肽標準液，同時參照桿菌肽的特異性測定結果。每個樣品3個平行。培養后測定抑菌圈大小，參考標準曲線，計算藥物質量濃度。
2結果與分析
2.1桿菌肽的標準曲線
桿菌肽稀釋液質量濃度的對數與抑菌圈直徑呈線性關系。以桿菌肽稀釋液質量濃度的對數作為橫坐標，以抑菌圈直徑作為縱坐標，得到桿菌肽在各基質中的標準曲線和相關系數。其中桿菌肽在1~10μg/mL內，標準曲線的線性關系良好，R2均大于0.990 0,在PBS中標準曲線回歸方程為y=0.1018x-1.3784;在草魚肌肉中標準曲線回歸方程為y=0.0883x-0.8608;在鰻鱺肌肉中標準曲線回歸方程為y=0.09x-0.7644;在對蝦肌肉中標準曲線回歸方程為y=0.1061x-1.2695.圖1為標準曲線中各標準質量濃度在一個檢測平板內的抑菌圈情況。
2.2桿菌肽的最低檢測限
表1為各組織添加藥物量分別為0.125、0.250、0.375、0.500μg/g下的抑菌圈直徑，其中草魚肌肉中添加量為0.250μg/g時可見清晰抑菌圈，直徑(11.69±0.60)mm,對蝦和鰻鱺肌肉中添加量為0.500μg/g可見清晰抑菌圈，直徑分別為(10.60±0.60)mm和(10.17±0.73)mm,空白樣品及添加量為0.125μg/g的各樣品均未見抑菌圈(直徑小于10mm)。相比于空白樣品存在顯著性差異。因此，草魚肌肉中最低檢測限為250μg/kg,對蝦和鰻鱺肌肉中最低檢測限為500μg/kg.
2.3桿菌肽的'添加回收率
桿菌肽在水產品可食性組織中添加回收率及其變異系數見表2.重復測定3次，不同水產品肌肉組織添加量在0.5~2.5μg/g時，草魚肌肉回收率為86.82%~92.56%,變異系數為2.32%~10.77%;對蝦肌肉回收率為81.61%~92.17%,變異系數為2.02%~11.80%;鰻鱺肌肉回收率為70.45%~93.44%,變異系數為4.48%~12.62%.各組織的回收率均在標準要求的范圍(70%~120%)。變異系數均小于15%,符合該方法的檢測要求。
2.4桿菌肽的特異性不同類別藥物對3種細菌的抑菌效果測定結果見表3.在一定范圍內，只對藤黃微球菌敏感的藥物是桿菌肽，而其他藥物或者對藤黃微球菌不敏感，或者對大腸桿菌和枯草芽胞桿菌敏感。利用不同藥物在3種細菌檢測平板中的抑菌效果可以排除所檢測的藥物是否為桿菌肽。
3討論
桿菌肽抗菌譜廣，目前被廣泛應用于飼料添加劑預防和治療疾病，但是由于使用不科學，藥物在產品中殘留很多，食用后給人體健康帶來嚴重影響。
歐盟規定了桿菌肽殘留檢測物為桿菌肽A、B和C3種組分之和，牛奶中桿菌肽的殘留限量為100μg/kg.中國和美國均規定，動物性食品豬、牛和牛奶、禽和禽蛋等可食組織中桿菌肽的最高殘留限量為500μg/kg,殘留檢測的標示物為桿菌肽A、B和C三者之和[14].在測定桿菌肽殘留量的方法中，色譜和液質聯用技術雖然檢測結果比較準確，但檢測藥物必須準確知道藥物的組分及其分子結構，而桿菌肽的提取純化目前還很難做到，各批次的藥物組分有一定的差別，所以難以應用該方法進行殘留量檢測。且色譜和液質聯用技術僅測定了桿菌肽A或者B,且前處理復雜，儀器昂貴，對另幾種含量較少的組分均未測定[9-11,13].相較于其他方法，微生物法則是一種經典的抗菌藥物殘留檢測方法[15-16],操作簡單，不需要昂貴的儀器，適合生產應用，且能夠有效檢測到這一類藥物(具有生物活性的多肽類)殘留的每種組分的活性總量。所以微生物學測定動物性食品中桿菌肽殘留的方法仍被廣泛應用[8-9,15].
根據藥物對某些特異微生物的殺滅或抑制效果，來定量或定性確定樣品中殘留的藥物，方法科學有效。
在對檢測菌種的篩選上，通過比濁法和杯碟法研究了藤黃微球菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌3種菌對桿菌肽的敏感性，最后發現藤黃微球菌對桿菌肽最敏感。與此同時，利用藥物對不同細菌具有不同的敏感性的特性，用其他微生物制作的多平板法檢測[17],確定了單一組分的殘留物為桿菌肽。中國獸藥典中有抗菌藥物的微生物檢定試驗，其中試驗設計表規定藤黃微球菌(CMCC28001)在pH值為6.5~6.6的培養基中，對桿菌肽、金霉素、多西環素等抗菌藥物的靈敏度最高。而枯草芽胞桿菌(CM-CC 63501)在pH值為7.8~8.0培養基內，對鹽霉素和吉他霉素等抗菌藥物的靈敏度最高[18].本試驗在一定濃度下，桿菌肽對藤黃微球菌最敏感，其他細菌不敏感。而其他藥物也具有類似敏感細菌的情況。通過篩選，確定了藤黃微球菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌這3種細菌的不同組合。參照不同藥物對3種細菌的抑菌情況，分析不同藥物對不同細菌能否產生有效抑菌圈(10~25mm)，發現制作的三檢定平板可以有效鑒定出單一殘留物是否為桿菌肽。
在對3種基質的標準曲線和PBS的標準曲線的比較中發現，每種肌肉對桿菌肽的抑菌效果都有不同的影響，影響由大到小依次為鰻鱺、草魚、對蝦。由3種基質的營養成分可以發現，鰻鱺的粗脂肪含量最高，草魚、對蝦很低，這與桿菌肽的在各基質中的回收率也相吻合，可見不同肌肉中脂肪含量的高低會影響藥物殘留的檢測結果，脂肪含量越高，檢測回收越困難。
測定桿菌肽在動物性組織中的殘留情況，其中樣品前處理的方法很重要。目前，常用于生物樣品中提取桿菌肽殘留的提取溶劑很多，如甲醇/甲酸[13,19]、乙腈/三氯乙酸[12]、甲醇/偏磷酸[20]等。其中我國曾頒布的出口禽肉中桿菌肽殘留量檢驗方法中，采用了吡啶來提取凍雞肌肉組織中桿菌肽的殘留[8].本研究比較上述提取溶劑的提取效果，發現甲醇/甲酸水提取效果較好。通過對甲醇、乙腈和丙酮3種單一提取劑在水產品各肌肉組織中桿菌肽殘留的研究，發現丙酮提取效果優于其他2種。但丙酮在提取后溶液含水和雜質多，氮吹濃縮中需要時間過長，最終選擇甲醇/甲酸水溶液，通過旋蒸濃縮，效果理想。提取后經正己烷脫脂，可去除大部分雜質，藥物復溶后過0.22μm濾膜，終試液澄清，抑菌圈清晰。
最終結果顯示，桿菌肽在各肌肉組織空白提取液1~10μg/mL范圍內，藥物質量濃度對數與抑菌圈的直徑線性關系良好(R2>0.990 0)，平均回收率70.45%~93.44%,變異系數2.02%~12.62%.
測定低限草魚肌肉為0.25μg/g,對蝦和鰻鱺肌肉為0.50μg/g,總體達到或低于我國農業部頒布的殘留限量的國家標準。桿菌肽殘留物還可以通過三細菌檢定平板確定。因此，本試驗建立的對水產品可食性組織中桿菌肽殘留量檢測的微生物方法是可行的，能夠滿足我國水產品可食性組織(肌肉)中桿菌肽殘留量檢測的要求。
參考文獻：
[1] 程美玲，高士爭.幾種新型安全抗生素類飼料添加劑[J].飼料世界，2001(10):4-6.
[2] 陳杖榴.獸醫藥理學[M].3版.北京：中國農業出版社，2010:261.
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