探討兔心肌缺血后處理的作用機制
己有的證據表明，STAT1和STAT3激活對心肌具有相反的作用，以下是小編搜集整理的一篇探究兔心肌缺血后處理的作用機制的論文范文，供大家閱讀參考。
缺血后處理(ischemicpostconditioning,IPO)即通過在心肌的再灌注早期經過反復短暫的缺血與再灌注,能減少心律失常的發生,改善心功能,縮小梗死面積,減少心肌細胞凋亡[1]。
Murry等[2]提出的預處理不同,IPO是在缺血后、再灌注之前進行反復短暫的缺血與再灌注。IPO可對已發生的心肌缺血事件起到挽救的作用,彌補了不可預知缺血事件造成的慌亂,盡量減少心肌的損害,有其更大的應用前景。但對其機制的研究尚未有公認的結論,有待進一步研究。本研究通過建立兔在體心肌IPO模型[3],觀察JAK-STAT通路在心肌IPO中的作用,進一步探討IPO的機制問題。
1材料與方法
1.1實驗動物
新西蘭大白兔,雌雄兼有,體質量2.5~3.0kg。將實驗用兔(雌雄兼有)40只隨機分為3組。組1(單純缺血再灌注組,I/R組,n=10)進行簡單的缺血再灌注,暴露左心室前降支(LAD),以1號絲線于中上1/3處旁開1mm進針縫線,橫穿LAD,另一端旁開1mm出線,剪針,套管,阻斷LAD遠端血流(以心電圖ST段抬高為標志)30分鐘后,開放120分鐘。組2(單純缺血后處理組,IPO組,n=10)于LAD的中上1/3阻斷30分鐘,開放后30秒再予阻斷30秒,再開放,如此反復3次。
即進行IPO,隨后再灌注120分鐘。組3(AG490+IPO組,n=10)于阻斷后10分鐘給予酪氨酸激酶抑制劑AG490(1mg/kg),其他操作同組2。
1.2材料與試劑
AG490(美國SIGMA公司);Tunel試劑盒(德國寶靈曼公司);TKR-200c小動物呼吸機(江西特力麻醉呼吸設備公司);RM6240C生理信號采集系統(成都儀器廠);熒光顯微鏡(日本Olympus公司);1.3數據采集以阻斷前10分鐘為起點,期間每10分鐘記錄1次左心室壓力情況,以LSD(是一種文件格式,由RM6240C系統自動生成)文件保存,RM6240C多道生理信號采集系統進行分析,所得數據保存于Excel表格中。每組分別于阻斷即刻、阻斷后20分鐘、再灌注后60分鐘、再灌注后120分鐘抽取2ml血液作為標本,進行心肌磷酸激酶(CPK)的檢測。最后處死動物,取缺血中心區心肌,裁減為黃豆大小置入4%多聚甲醛固定液和10%中性緩沖固定溶液中保存,做好標記。固定48~72小時后進行常規石蠟包埋,進行Tunel檢測觀察細胞凋亡情況。
1.4統計學方法采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析,實驗數據均以均數±標準差(x-±s)表示,組間比較采用方差分析,不同時點間的比較采用重復測量的方差分析。
P<0.05表示差異有統計學意義。
2結果
2.1CPK的變化
不同組間差異有統計學意義(P<0.01),時點間差異有統計學意義(P<0.01),組別與時點間存在交互作用(P<0.01),進一步分析組間和時間的單獨效應,各組的CPK于阻斷后較缺血前明顯增加(P<0.05),組1和組3再灌注120分鐘較60分鐘下降,差異有統計學意義(P<0.05);組2CPK于再灌注60分鐘和120分鐘后較組1顯著降低(P<0.05),而組3與組1再灌注后60分鐘兩者之間比較差異無統計學意義,結果見表1。
2.2心功能指標的變化
本實驗以RM6240C多道生理信號采集系統分析了所記錄的壓力波形,通過該系統給出的參數,我們對左心室內壓上升及下降最大速率(±dp/dtmax,即在收縮期單位時間內左心室壓力上升的最大速度,以“+”號表示,反映了心室的收縮功能;舒張期單位時間內心室壓力下降的速度,以“-”號表示,反映左心室的舒張功能),采用SAS軟件進行了LINEPLOT分析,以時間作為X軸,±dp/dtmax作為Y軸(圖1~3)。
±dp/dtmax是反映左心室收縮功能及舒張功能的重要指標,越靠近0點表明心功能越差,對比組1與組2,可看出組1心功能呈下降趨勢;而組2不明顯,說明IPO對心功能起到了保護作用。組3波形也向0點靠近,說明AG490阻斷了后處理的保護作用。
2.4心肌細胞凋亡變化
光鏡下隨機選取10個視野(×400)計數陽性細胞占視野中總細胞的千分率。
每張切片隨機選取視野,計數100個細胞,并計數細胞核呈現棕黃色顆粒的陽性表達細胞,其總和即為這張切片心肌凋亡細胞的千分率。在鏡下可以看到組1與組2的陽性率較高,并可見凋亡細胞經常簇集在一起;組3的心肌凋亡細胞相對較少。組2的細胞凋亡千分率均小于組1(P<0.01),組3與組1差異無統計學意義,見表2。
3討論
在缺血再灌注時進行IPO,激發機體的內源性心肌保護機制系統,最終結果起到了心肌保護的作用。但對于該機制是存在于器官、組織、細胞哪一級水平,作用于哪一條細胞通路,是一條或是多條通路相互起作用,人們先后提出了各種觀點,比如抑制中性粒細胞活化[4-5],減少氧化劑介導的細胞損傷[2-4],抑制細胞內和線粒體內鈣超載[5-6],激活再灌注損傷補救激酶途徑(RISK)[6-9]等。本研究通過建立兔的心肌缺學后處理模型,研究JAK-STAT通路在兔心肌IPO中的作用,進一步探討IPO的作用機制問題。
JAK-STAT通路是人們在研究干擾素(IFN-α、IFN-γ)對培養細胞基因轉錄的誘導作用時發現的`,JAK和STAT都屬于多成員家族。
JAK家族是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶(PTK),其分子質量為120000~130000,有JAK1、JAK2、JAK3和TYK2等4個成員。該家族中的成員由7個功能域構成[10],JH1(JAKhomologyregion1)是有PTK催化活性的激酶功能域;JH2為激酶樣功能域,由于缺乏激酶活化所必需的氨基酸殘基而沒有激酶活性,同時是與STAT結合的部位[11]。STAT是一種DNA結合蛋白,結構中含有SH2、SH3功能域。
STAT家族共有7個成員,即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。其結構域中C端的酪氨酸磷酸化(Tyr-P)有助于形成同源或異源二聚體。
研究證實,細胞因子與細胞因子受體結合后,其受體的胞內部分發生二聚體化,JAK與二聚體化受體的box功能區結合并發生磷酸化而激活。活化的JAK進一步誘發二聚體受體復合物周圍的PTK底物活化,包括細胞因子受體型PTK、JAK家族成員和STAT等。
STAT是JAK激酶底物,可通過SH2功能域與二聚體受體復合物的酪氨酸位點以及JAK上的KLD功能區域結合。
STAT的y功能域在JAK的作用下發生Tyr-P,STAT被激活。胞漿內活化的STAT通過SH2功能域形成同源或異源二聚體,如SIF-A(STAT3和P48等構成)、SIF-B(STAT3-STAT1)、SIF-C(STAT1-STAT1)等。這些二聚體通過特定的機制移位到細胞核內并進一步結合到相應靶基因的啟動子上,啟動基因表達[12-13]。
我們假設JAK-STAT通路在心肌的IPO中也發揮了一定的作用。本實驗結果中組2較組1在心肌酶、心功能的變化、細胞凋亡等方面均有明顯的改善,IPO確實起到了心肌保護作用,證明本實驗成功復制了兔在體心肌缺血后處理模型。而組3與組2相比,在心肌酶、心功能的變化、細胞凋亡等方面均無明顯的改善,說明AG490可以消除后處理的保護作用,而作為JAK-STAT通路的特異性抑制劑,AG490只能通過作用于JAK-STAT通路,由此可證明JAK-STAT通路在心肌的缺血后處理中也發揮了不可替代的作用。
2001年,Omura等[14]發現,在體心肌缺血時,血管緊張素(AngⅡ)信號是心肌JAK-STAT通路激活的主要原因。隨后,Mascareno等[15]發現,缺血再灌注選擇性激活STAT5a和STAT6,激活的STATs與血管緊張素原(angiotensinogen,Ao)基因啟動子St結構域結合,上調Ao-mRNA的表達。
2000年,Kodama等[16]研究發現JAK2抑制劑AG490能夠強烈抑制培養心肌細胞的ANP的表達,表明JAK-STAT通路參與了血管舒-縮活性肽的表達。這與本實驗的結果一致,應用AG490后,IPO+AG490組的后處理的保護作用也被消除。
己有的證據表明,STAT1和STAT3激活對心肌具有相反的作用,STAT1的激活誘發凋亡,而STAT3激活卻抑制凋亡,發揮心肌保護作用[17]。
Yamaura等[18]通過基因敲除小鼠研究發現,STAT5a敲除的小鼠其缺血預處理的保護作用消失,而STAT6敲除的小鼠其缺血預處理的保護作用仍然存在,說明STAT5a在缺血預處理中發揮了積極作用,而且證明STAT5a可以同時被JAK-STAT、SrcKinase兩條途徑激活,SrcKinase激活的STAT5a通過PI3K磷酸化Akt而達到心肌保護作用。結果表明JAK-STAT信號通路可以通過和其他通路的交談(cross-talking)而發揮作用,這就增加了JAK-STAT通路的復雜性。
新近的研究表明,機體內存在多種下調JAK-STAT信號通路的調節途徑,除受體入胞這種常見的信號下調途徑外,至少有3個蛋白質家族抑制JAK-STAT信號通路:細胞因子信號抑制物(supressorsofcytokinesibnalling,SOCS)、活化STATs抑制蛋白(PIASproteininhibitorsofactivatedSTATs)和含有SH2結構域的磷酸酶(SHPSH2-containingphosphatase)[11,19]。SOCS蛋白家族共有7個成員,即SOCS1-SOCS7。SOCS蛋白家族是STAT激活的靶基因產物。
STAT激活誘導SOCS表達,表達的SOCS又以負反饋的形式抑制JAK-STAT信號通路的活化[19]。目前,SOCS蛋白家族對JAK-STAT信號通路的調節作用己被充分證實,但其發揮負反饋調節作用的確切機制尚未明了。
PIAS家族是一組能與STATs結合的蛋白質。日前己發現5個成員,PTAS1、PTAS3、PIASy、PIASxa、PIASxb。PIAS可與激活的STATs二聚體結合,阻斷該二聚體與DNA結合。SHP是存在于細胞質中的磷酸酶。
SHP1,SHP2能使JAKS和STATs去磷酸化,從而發揮抑制JAK-STAT信號通路的作用。另一方面,機體內尚存在JAK-STAT信號通路的正調節機制,包括絲氨酸激酶和一些相互作用的蛋白質。
STATs羧基末端轉錄激活結構域含有一個絲氨酸殘基,2001Kovarik等[20]研究發現,該絲氨酸殘基磷酸化可增強STAT1、STAT3、STAT4的轉錄活性,提高部分靶基因的表達。此外,STATs還可以和其他的轉錄調節物相互作用,如:STAT1與NF-B、SP1、糖皮質激素受體等,從而構成了一個十分復雜的調節體系。
最后,我們可以認為:
①心肌缺血后處理可以減少心肌酶的釋放,心肌細胞凋亡,改善心功能。
�、贘AK-STAT通路參與了缺血后處理的保護機制。但是JAK-STAT通路與其他通路的交匯作用,以及JAK-STAT家族中是否全部參與了IPO的保護機制還不清楚,有待于進一步的研究。
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