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探討N�；蛏┎⑧邕虬奉愌苌锏脑O計論文
20 世紀中葉以來, 隨著老年人口的快速增加及老年癡呆癥發病率的增高, 老年癡呆癥的防治已成為全球關注熱點。老年癡呆癥病人的平均生存期為5～10 年, 老年癡呆癥是老年人群中僅次于心臟病、惡性腫瘤和中風的第4 位死亡原因。臨床上老年癡呆有3種: 一是老年性癡呆, 又名阿爾茨海默病 (Alzheimer’sDisease, AD); 二是血管性癡呆, 主要是由腦血管病引發的癡呆, 包括多發性梗死或出血灶所致的老年癡呆; 三是混合型癡呆, 指既有老年性癡呆, 又有血管性癡呆或其他類型的癡呆。其中以AD 最為常見。許多研究都證明AD 患者的認知功能障礙跟他們的前腦膽堿能神經系統受損有關系，從而認為患AD 病的主要原因是腦內膽堿能系統受到損害, 因此Bartus 等提出“膽堿能假說”: 前腦膽堿能神經元系統的神經傳遞缺陷與大腦皮質、海馬體及其他部位膽堿能遞質的缺失, 引起乙酰膽堿基轉移酶 (ChAT)和乙酰膽堿酯酶 (AChE) 活性降低, 使乙酰膽堿(ACh) 濃度降低, 這是AD 患者認知功能損害的主要原因。大量學者認為增強膽堿能活性的藥物可以改善AD 患者的學習記憶能力。中樞膽堿能遞質在學習與記憶中起著重要的調節作用。神經遞質乙酰膽堿 (ACh) 的降低是AD 最主要的特征。目前治療AD 的主要藥物為抑制乙酰膽堿酯酶降解的乙酰膽堿酯酶抑制劑, 現在用于臨床上治療AD的主要藥物有他克林 (tacrine)、多奈哌齊 (donepezil)、加蘭他敏 (galantamine)、利斯的明 (rivastigmine)、石杉堿甲 (huerzine A) 和美曲磷酯 (metrifonate)。由于這些藥物只能緩解輕、中度AD 患者的病情, 不能從根本上治愈, 對重癥AD 的患者的治療也沒有顯著的療效。因此, 迫切需要研發新的高效、低毒的AD藥物。本實驗室近來合成了一個新化合物I,在抑制AChE 活性方面有一定的效果。硫色滿酮是合成雜環化合物的常用試劑, 它們是一類含有硫原子的雜環化合物, 以多種形式存于天然產物中, 有較強的生物活性。近年來, 人們將此類化合物應用于AD治療領域中, Rampa 等[10]用硫色滿酮和利斯的明結構中的氨基甲酸酯藥效基團通過長碳鏈拼接, 合成了具有AChE 抑制活性的硫色滿-4-酮類衍生物, 以此類化合物為基礎的乙酰膽堿酯酶抑制劑的合成研究成為了目前的一個熱點�；衔颕 的活性弱于對照藥多奈哌齊, 因此對結構進行優化, 將苯基噻唑的開環結構關環來考察其乙酰膽堿酯酶的抑制活性。本文在化合物I 的化學結構基礎上, 以硫色滿-4-酮代替苯乙酮, 合成了一系列N-�；蛏┎⑧邕�-2-胺類衍生物II, 并考察了它們對AChE 的抑制作用,為新的乙酰膽堿酯酶抑制劑的開發做探索性研究。具體反應過程見合成路線1。
結果與討論
1 目標化合物的合成
合成的化合物結構經1H NMR、MS、元素分析及IR 得以確證, 理化數據。
2 乙酰膽堿酯酶體外抑制活性
合成化合物的體外AChE 抑制活性實驗表明,制備的18 個化合物均有一定的體外抑制乙酰膽堿酯酶的活性 (如表3 所示)。其中10a 表現出較好的AChE 抑制活性, 其IC50 分別為7.96 μmol·L1 和7.88μmol·L1, 取其平均值為7.92 μmol·L1, 其活性高于對照藥利斯的明, 但低于對照藥多奈哌齊。從合成的化合物的活性數據可以發現不同取代基與生物活性的部分相互關系如下: 在A 處,苯環上R1 取代基對生物活性的影響: F、Cl、CH3 的活性依次增強, 例如表3 中化合物的IC50 活性大小為: 11a (R1=CH3) > 5a (R1=Cl) > 8a (R1=F)。在B 處,�；兼淩2 上多了一個碳原子, 抑制酶的效果明顯增強, 例如表3 中化合物的IC50 的活性大小為: 6a(R2=CH2CH2) > 5a (R2=CH2), 這說明酰胺N 上碳鏈的長短對抑制活性起著重要的影響。在C 處, R3 上的取代基丙基代替了乙基, 活性減弱, 如表3 中化合物的IC50 活性大小為: 4a (R3=(CH2)2) > 5a (R3=(CH2)3)。在D 處, 叔胺上的R4 取代基二甲氨基對生物活性的影響要比二乙氨基大, 如表3 中化合物的IC50 活性大小為: 4a (R4=CH3) > 4b (R4=CH2CH3)。
實驗部分
所有實驗材料除另作說明外, 均為市售。乙酰膽堿 (電鰻) 購自Sigma 公司。用SGW X-4 顯微熔點儀測定熔點 (上海精密科學儀器有限公司)。1H NMR由Bruker AVANCE600 核磁共振儀 (CDCl3 為溶劑, TMS 做內標) 測定。高分辨質譜由Bruker apex ultra7.0 T 傅里葉變換型質譜儀測定; 紅外光譜采用FTIR-8400S 傅里葉變換紅外分光光度計。96 孔板讀取用1420 Victor 酶標儀。
1 化合物的合成
1.1 化合物1～3 的合成 (以1 合成為例)
取5.94 g(30 mmol) 6-氯硫色滿-4-酮置于250 mL 圓底燒瓶中,加入冰醋酸30 mL 使之完全溶解, 取5.21 g (33 mmol)液溴置于加有適量冰醋酸的恒壓漏斗中。溫度控制在40 ℃, 將溴的冰醋酸溶液緩慢滴加到上述圓底燒瓶中, 控制滴加速度 (每分鐘20 滴), 50～60 min 滴加完畢, 繼續在40 ℃下反應3～4 h。反應完畢后靜置,冷卻至室溫。向上述體系中加入飽和亞硫酸氫鈉溶液,有大量絮狀沉淀析出, 抽濾, 濾餅用大量水洗至中性。室溫干燥后得到淡黃色固體3-溴-6-氯硫色滿-4-酮。取3.04 g (40 mmol) 硫脲置于250 mL 圓底燒瓶中, 加入70 mL 無水乙醇, 加熱回流。待硫脲完全溶解后, 取5.52 g (20 mmol) 3-溴-6-氯硫色滿-4-酮, 分批加入反應體系中, 反應1 h 后停止反應, 靜置冷卻。減壓下旋干溶劑, 向殘余物中加入飽和碳酸氫鈉溶液, 至pH 值為8～9, 然后用二氯甲烷萃取3～4 次,合并有機相。減壓下旋干有機溶劑, 剩余物經硅膠色譜柱 (洗脫劑為乙酸乙酯與石油醚, 體積比1∶2) 分離純化得到黃色固體3.04 g。用類似的方法得到化合物2、3, 物理和光譜數據。
1.2 化合物4～12 的合成 (以4 合成為例)
取2.58 g(10 mmol) 2-[4-(2-溴乙氧基)苯基]乙酸和3.04 g (12mmol) 的1 溶于50 mL 二氯甲烷中, 然后加入3.85 g(12 mmol) TBTU, 常溫下反應過夜。反應完后將體系中的溶劑旋干, 剩余物經硅膠色譜柱 (洗脫劑為乙酸乙酯與石油醚, 體積比1∶4) 分離純化得到黃色固體3.80 g。用類似方法合成化合物5～12, 物理和光譜數據見表4 和表5。
1.3 化合物4a～12a 和4b～12b 的合成 (以4a 合成為例)
取1.98 g (4 mmol) 的化合物4 溶于乙腈, 加入0.53 g (4.8 mmol) 二甲胺鹽酸鹽、1.1 g (8 mmol)碳酸鉀和0.88 g (8 mmol) 碘化鉀, 加熱回流 (80 ℃),反應2 h 后停止, 靜置冷卻。然后旋干溶劑, 用飽和碳酸氫鈉溶液調節pH 到8～9 左右, 用二氯甲烷萃取3～4 次, 合并有機相, 旋干溶劑。剩余物經硅膠色譜柱 [洗脫劑為乙酸乙酯與石油醚 (含1% 的三乙胺), 體積比1∶1] 分離純化得到棕色固體1.25 g。用類似方法合成化合物5a～12a 和4b～12b。
2 體外AChE 抑制試驗
采用Ellman 分光光度法在體外考察化合物對電鰻乙酰膽堿酶的抑制作用, 同時用空白組, 利斯的明、多奈哌齊為陽性對照組進行實驗。配置Tris 緩沖液pH 為7.2, 底物ACTI (碘化硫代乙酰膽堿) 的濃度為0.6 mmol稬1, 顯色劑DTNB 的濃度為3 mmol稬1,電鰻AChE 總量為0.035 U, 抑制劑的配置濃度分別為1?105、1?106、1?107、1?108、1?109 mol稬1。分別取20 μL Tris 緩沖液、10 μL 電鰻AChE、10 μL各濃度的抑制劑于96 孔板中, 37 ℃下保溫12 min, 然后加入10 μL 底物ACTI 和50 μL 的顯色劑DTNB,5 min 后使用1420Victor 多標計數儀在405 nm 處讀取每孔吸光度�？瞻捉M用10 μL Tris 緩沖液分別代替底物和抑制劑, 標準組用10 μL Tris 緩沖液代替抑制劑, 每個化合物在不同濃度均實驗3 次, 然后以抑制率I (I = 100?(A 測A 空)/(A 標A 空)%) 對抑制劑濃度C作圖, 進行S 型曲線線性擬合, 得到半數抑制率IC50對應的濃度Cx, 為了得到準確的IC50, 從1?105～1?109 mol稬1 中選擇最接近Cx 的濃度1?10xmol稬1, 且1?10x mol稬1 小于Cx。配制1?10x、3?10x、5?10x、7?10x、9?10x mol稬1, 同法操作酶抑制實驗, 然后以抑制率I 對抑制劑濃度C 作圖,進行直線線性擬合, 求出IC50。
3 小結
合成的大部分的N-�；蛏┎⑧邕�-2-胺類化合物都有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性, 化合物10a 的生物活性是其中最好的, 其IC50 值達到了7.92μmol·L1, 活性優于對照藥物利斯的明。這說明N-�；蛏┎⑧邕�-2-胺類化合物的結構值得進一步研究。
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