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成纖維細胞系及生物學特性分析論文
１細胞生物學特性
１.１細胞活力測定
采用Ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ拒染試驗檢測凍存前及復蘇后細胞的存活率。將待檢細胞制成細胞懸液，取細胞懸液與０４％臺盼藍溶液以９∶１混合均勻（使臺盼藍溶液終濃度為００４％），３ｍｉｎ后觀察，并用血球計數板計數。鏡下觀察可見健康活細胞胞體完整、細胞透明、不著色，凡著色呈藍色者均為死細胞。計數１０００個細胞，計算細胞活率。
１.２生長曲線繪制
向２４孔培養板每孔內接種１ｍＬ密度約為１×１０４個／ｍＬ細胞，從接種之日算起，每隔２４ｈ計數２個孔內的細胞密度，算出平均值，連續測定１２ｄ，以培養時間為橫坐標，以細胞密度為縱坐標，繪制細胞生長曲線。
１.３細胞染色體分析
選取第４代生長良好的新生昆明犬成纖維細胞，按照常規方法［９］進行染色體制片，Ｇｉｍｅｓａ染色后選擇染色體分散與形態良好的分裂相在油鏡下觀察拍照，作核型圖，對５０～１００個分裂中期細胞進行染色體數目統計。
２結果與分析
２.１細胞的形態學觀察
新生昆明犬耳緣皮膚組織經膠原酶分離培養３～４ｄ后，鏡下觀察可見有少數細胞沿組織塊邊緣慢慢貼壁伸展，細胞形狀不規則，且其組織塊的生長暈形成時間較長。經８～１０ｄ培養才出現大量成片生長的優勢細胞，此時觀察細胞的形態呈長梭形、多角形或扁平星形，為典型的成纖維細胞形態。后再經３～４ｄ細胞生長至匯合，并長滿整個細胞培養瓶表面（圖１Ａ），此時可進行傳代和凍存。傳代后的細胞生長旺盛，在形態上與原代細胞無明顯差異，經２～３ｄ即可長至近１００％匯合，此時細胞呈放射狀或渦旋狀走勢（圖１Ｂ）。待傳代時，加入消化液后顯微鏡下可見細胞回縮，呈圓形（圖１Ｃ）。
２.２成纖維細胞凍存前和復蘇后的活
耳部成纖維細胞凍存前和復蘇后的活率分別為９３３％，９０８％（圖２）。凍存前與復蘇后的細胞存活率差異不顯著（Ｐ＞００５），說明原代細胞和傳代細胞生長狀態良好，培養條件適宜，且凍存和復蘇的過程對細胞活力狀況損害較小。
２.３生長曲線
根據昆明犬耳部成纖維細胞接種于２４孔板連續培養１２ｄ的細胞計數情況，繪制出了成纖維細胞的生長曲線（圖３）。昆明犬耳部成纖維細胞的生長曲線呈典型的“Ｓ”形，即經過了潛伏生長期、對數生長期、平臺期以及衰亡期。其表現為１～２ｄ的潛伏生長期細胞總數基本保持不變，從第３天起，細胞數量開始增加，３～８ｄ左右細胞明顯地進入對數生長期，細胞數量快速增長，第８～９天，細胞由于缺乏足夠生長空間而增長放緩，開始進入平臺期。第９天后，由于細胞數量的急劇增加、生長空間的極大限制，經過短暫的平臺期后，細胞發生接觸抑制快速進入衰亡期，細胞生長幾乎停止，隨后細胞逐漸脫落死亡，此時鏡下可見有大量凋亡細胞漂浮。由生長曲線上的數據分析，耳部成纖維細胞群體倍增時間約為３２ｈ。
２.４核型觀察分析
昆明犬耳部成纖維細胞中期染色體分裂相與核型分析如圖４所示：染色體數目２ｎ＝７８（ＸＸ）。計數８０個４代細胞的染色體數目，總數２ｎ＝７８的細胞數約占總細胞數的９０％，達到了建立細胞系７５％～８０％的要求，說明所建細胞系為穩定的二倍體細胞系。３９對染色體中有３８對常染色體均為端著絲粒（Ｔ）染色體，長度逐漸遞減；性染色體Ｘ，Ｙ均為中央著絲粒（Ｍ），Ｘ染色體的長度最大。
３討論
目前，國內已有一些研究報道建立了比格犬胎兒成纖維細胞系［１０］、德國牧羊犬耳部和腹部成纖維細胞系［１１］及雜交犬大腿內側皮膚成纖維細胞系［１２］等，但利用犬類的這些細胞遺傳資源進行更加廣泛深入的研究（如醫療和動物模型的建立、體細胞克隆等）還十分欠缺。在國外，已有較多使用所建立的犬胎兒或成體成纖維細胞系進行體細胞核移植（ＳＣＮＴ）的研究［１３－１６］。值得注意的是，在警用工作犬領域，７頭世界首批體細胞克隆警犬于２００７年底在韓國誕生［１７］，２００９年韓國克隆專家根據美國９１１英雄警犬“特拉克”的遺傳信息，再次利用體細胞克隆技術成功獲得了５頭牧羊犬。ＬＥＥ等［１８］將曾服役于韓國國家緊急事務管理署（ＮＥＭＡ）具有６年全球救援經驗的退役搜救犬進行克隆，最終獲得２頭克隆犬。這些克隆后代中大多數工作犬已服役并具備與父輩同樣卓越的工作性能。同時，ＯＨ等［１９］的研究也表明，利用ＳＣＮＴ技術將能使一頭優秀的檢驗檢疫犬復制出一群同樣優秀的檢驗檢疫犬。體細胞克隆技術最大的優勢在于克隆出生的動物與供體細胞來源的動物具有幾乎１００％相同的基因，即能完全保持親代優異的先天特質。要成為一只優秀的警犬，就必須要具備高智商、敏銳的嗅覺、良好的親和能力等警犬所必備的各種特質。按照傳統的警犬繁育方式，培育出一頭優秀警犬至少需要３～４年時間，花費約１０萬元，期間要消耗大量的人力、物力和時間，且培訓的優秀率低，不超過１２％；而要培養出一頭功勛級的警犬需要付出的代價就更大，最少需數１０人，４～５年時間，約５０萬元的費用，且培養出一頭功勛級警犬的效率很低，約８‰。而動物體細胞克隆技術可以批量復制優秀、功勛級的警犬，可以大大降低培育成本，提高培養功勛警犬的培育效率。因此，體細胞核移植技術在警犬繁育中具有廣闊的應用前景。然而，體細胞核移植技術首先必須要解決的是供體細胞的來源和體細胞分離培養的問題。本研究利用膠原酶消化法建立了新生昆明犬耳部成纖維細胞系，并對其體外培養的生物學特性也進行了初步的分析與探討。在動物成纖維細胞的體外分離培養中，分離組織可以取自胎兒、新生幼仔及成體動物［２０－２２］。其中，胎兒取材不僅難度大、成本高，且對優良品種的保存也十分不利。相反地，新生幼仔或成體動物耳部、腹部及腹股溝等部位皮膚組織的取材則顯得十分便捷，且不影響動物的健康成長。本試驗取材自新生昆明犬耳緣皮膚組織（＜１ｃｍ２），對于新生仔犬，其傷口愈合快、皮膚組織修復能力強，應激性小且容易護理。另外，新生幼犬較成犬組織分化程度低，其成纖維細胞理論上應具有較強的增殖能力、易培養及適于進行相關基因操作研究。本試驗所建立的新生昆明犬耳部成纖維細胞具有典型的成纖維細胞形態，如細胞呈梭形或星形，當生長至匯合時細胞會平行排列，呈渦旋狀和放射狀生長。其凍存前和復蘇后存活率差異不顯著（Ｐ＞００５），細胞復蘇后增殖快、生命力旺盛，且形態未發生變化。這表明凍存和復蘇過程中的各項條件對細胞活力影響較小，試驗中采用的凍存和復蘇的方法是可行的。
在離體培養條件下，昆明犬耳部成纖維細胞生長曲線遵循典型的“Ｓ”形，細胞接種后有１～２ｄ的潛伏期，從第３天起細胞進入對數生長期，約６ｄ后細胞長滿細胞瓶后進入平臺期，細胞進入接觸抑制狀態，增殖緩慢，隨后細胞生長狀態下降，部分細胞開始死亡。這與寧小檬等［１１］描述的德國牧羊犬耳部皮膚成纖維細胞的生長曲線完全一致，并與葉雷等［２３］描述的版納微型豬近交系成年豬耳部成纖維細胞的生長曲線基本一致。在細胞培養中，昆明犬耳部成纖維細胞體外培養的生長速度會隨著細胞培養代數的增加而變慢，細胞的適應期增長，當細胞傳代到１２代時就明顯開始老化，增殖減慢，細胞形態變大，胞內出現大量空泡狀顆粒物，到１５代時已基本停止增殖。該現象的產生可能是由于細胞本身端粒酶長度的縮短或體外培養環境對細胞ＤＮＡ造成的損傷，從而導致細胞的遺傳穩定性有所改變［２４］。在進行核型制備分析時，由于犬染色體較多（７８條），其中３８對常染色體均為端著絲粒染色體且長度逐漸遞減，因此犬的染色體核型分析也成為哺乳動物中最困難的核型分析之一［２５］。由于很多常染色體的著絲粒不明顯，著絲粒與長臂末端容易混淆，致使核型排列時容易導致染色體方向的顛倒。然而，在本試驗中利用Ｇ帶技術進行核型分析，使染色體形態鑒定、同源染色體配對、核型排列都較為準確。昆明犬染色體數目及核型特征與已報道的其他犬的染色體核型分析結果基本一致［２５－２６］。但隨著染色體長度的減短，Ｇ帶帶紋數目減少且不夠清晰，今后需要進一步改進試驗方法進行深入研究。綜上所述，本研究成功地建立了昆明犬成纖維細胞系，彌補了昆明犬成纖維細胞培養與生物學特性研究的空白。同時，該細胞系的建立對于昆明犬種質資源的保存以及相關繁殖生物技術研究具有重要的意義。此外，隨著細胞工程和基因操作技術的發展和成熟，建立穩定的新生昆明犬體細胞系是開展功勛犬的體細胞克隆、犬的疾病模型構建等各項研究的基礎。
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