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γ-谷氨酰轉肽酶酶學性質的研究
【摘要】 目的了解地衣芽孢桿菌菌體細胞中γ-谷氨酰轉肽酶的一些基礎酶學性質。方法 采用溶菌酶法破碎細胞壁，經硫酸銨沉淀后透析得到粗酶后，采用紫外分光光度法測定該酶的酶活力。結果 該酶在25~35℃的溫度范圍有很好的耐受性，在堿性條件下保持一定的活性，最適反應溫度為45℃，最適反應pH值為8.0，Ca2+ 、Mg2+等金屬離子在適當濃度時對酶活性有促進作用。結論 本實驗為利用該酶轉化生產茶氨酸提供了依據。
【關鍵詞】 γ-谷氨酰轉肽酶;酶學性質;茶氨酸
Abstract:Objective To understand some basic properties ofγ-glutamyltranspeptidase from Bacillus licheniformis.Methods Lysozyme were used to disrupt the cell wall and ammonium sulfate were used to separate precipitation and dialysis,at last the crude enzyme were obtained. UV spectrophotometry were used to measured the enzyme activity. Results This enzyme was well tolerant to temperature in the range of 25~35 ℃,but in alkaline conditions,it maintained a certain activity,the optimum reaction temperature was 45 ℃ and optimum reaction pH 8.0,generally the appropriate concentration of metal ions,such as Ca2+,Mg2+,had a positive effect on the activity. Conclusion This experiment could be used in production of theanine with γ-glutamyltranspeptidase.
Key words: γ-glutamyltranspeptidase; enzymological property; L-theanine
γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP,EC 2.3.2.2),又稱γ-谷氨酰轉移酶,在生物體內廣泛存在,是谷胱甘肽(GSH)代謝的關鍵酶之一。該酶還參與了氨基酸的跨膜轉運,可特異性催化γ-谷氨酰基的轉移反應[1]。人們對γ-GTP的早期研究局限于該酶在GSH代謝中所起的作用[2]。隨著研究的深入,人們對γ-GTP的催化功能和分子結構有了更多的了解,并發現其在臨床上可作為肝膽疾病的生物標志,被廣泛應用于肝病及其他臟器疾病的診斷和預后檢測[3-4] 。近年來,由于生物技術發展突飛猛進,生物催化與生物轉化技術在工業生產中逐漸興起,利用γ-GTP制備系列γ-谷氨酰基類化合物的研究已成為生物催化領域的熱點。已有報道利用γ-谷氨�；�(γ-glutamylization)反應合成了GG-DOPA等多種化合物[5-7]。目前，利用來源于枯草芽孢桿菌、基因工程改造的大腸埃希菌的γ-GTP生產茶氨酸[8] (L-theanine,γ-L-glu-ethylamide)越來越受到人們的關注。該方法利用γ-GTP將L-谷氨酰胺上的γ-谷氨�；D移到乙胺受體上,催化合成L-茶氨酸。但利用地衣芽孢桿菌發酵所產的γ-GTP轉化合成茶氨酸尚未見報道。本文利用實驗室篩選的γ-GTP高產菌株地衣芽孢桿菌發酵產酶，并研究該菌株所產的γ-GTP的基礎酶學性質，為進一步利用地衣芽孢桿菌所產的γ-GTP生產茶氨酸提供依據。
1材料與方法
1.1主要材料與試劑
菌種：地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)由本實驗室篩選獲得。試劑：Tris 購自北京普博欣生物公司;L-γ-谷氨酰對硝基苯胺、雙甘肽均購自廣州威佳科技有限公司;硫酸銨為國產分析純。
1.2地衣芽孢桿菌的產酶發酵
用接種環在活化好的菌種斜面上刮下一環菌種，將其轉入到種子培養基，30 ℃、240 r/min搖床振蕩培養16 h。以20%接種量轉接于發酵培養基(30 mL發酵液/300 mL三角瓶)中，在30 ℃下240 r/min搖床培養28 h后收集菌體。
1.3γ-GTP粗酶的制備
γ-GTP發酵瓶培養液離心(4 800 r/min,10 min)，棄上清液，用TE緩沖液(Tri-HCl 緩沖液,pH 8.0，10 mol/L)重懸菌體,采用溶菌酶法以及硫酸銨鹽析法制備粗酶液。
1.4酶對溫度的耐受性
以TE pH8.0為緩沖液，不同溫度下保存20 min，測定酶活力[1]。
1.5酶對pH的耐受性
pH2.0采用Na2HP04檸檬酸緩沖液; pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc緩沖液;pH7.0采用磷酸鹽緩沖液;pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl緩沖液;pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH緩沖液;在25 ℃下保存30 min，測定酶活力。
1.6酶的最適反應溫度
以TE pH8.0為緩沖液，分別在不同溫度下測定酶活力。
1.7酶的最適反應pH
pH2.0采用Na2HP04-檸檬酸緩沖液; pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc緩沖液;pH7.0采用磷酸鹽緩沖液;pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl緩沖液;pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH緩沖液，采用酶活測試方法檢測酶活力。
1.8金屬離子對酶活力的影響
在反應體系中分別加入各種金屬離子，終濃度均為5 mmol/L，采用酶活測試方法檢測酶活力。
2結果
2.1酶對溫度的耐受性
γ-GTP對40 ℃及以上溫度的耐受性較差，當溫度達到50 ℃時，經過短時間的保存,酶活力基本喪失。但在25~35℃的溫度范圍有較好的穩定性，特別是在常溫下，經過20 min的保藏，酶活力基本未變。因此該酶的保藏條件比較簡單，適合工業生產茶氨酸。見圖1。[PSc1781;S*2〗圖1γ-谷氨酰轉肽酶對溫度的耐受性Figure 1Temperature tolerance of γ-GTP
2.2酶對pH的耐受性
γ-GTP對酸性環境的耐受性很差，在pH低于5.0時，短時間保存后酶活力基本喪失，而在堿性條件下，最高可以耐受pH11.0的環境而保持較高的酶活力。其中pH8.0是其最佳的保藏pH。因此可以選用pH8.0的緩沖液保存該酶。見圖2。 [PSc1782;S*2〗圖2γ-谷氨酰轉肽酶對pH的耐受性Figure 2Tolerance to pH of γ-GTP
2.3酶的最適反應溫度
γ-GTP對溫度的適應性很強，在37~55℃以下均具有較高的酶活力，其中在45 ℃時酶活力最高。因此可以確定按照γ-GTP酶活力檢測方法得到γ-GTP的最適反應溫度為45 ℃。見圖3。
2.4酶的最適反應pH值
γ-GTP對酸性環境適應力很差，而在弱堿性條件下表現出較高的酶活力，其中在pH8.0時酶活力最高。因此可以確定按照γ-GTP酶活力檢測方法得到γ-GTP的最適反應pH為8.0。見圖4。
2.5金屬離子對酶活力的影響
在反應體系中加入5 mmol/L的各種金屬離子除亞錫離子外均會對酶的活力有促進作用。但在金屬離子中，一價金屬離子鉀離子和鈉離子以及三價金屬離子鐵離子和鋁離子的加入對酶的促進作用明顯低于二價金屬離子錳離子、鈣離子和鎂離子。另外，添加重金屬離子亞錫離子由于會引起蛋白質的變性，致使酶活力消失;有的金屬離子如錳離子、鎂離子等可較大程度的提高酶活力，這可能是由于這些金屬離子會對γ-GTP的活性中心產生影響的緣故。見圖5。[PSc1783;S*2〗圖3γ-谷氨酰轉肽酶最適反應溫度Figure 3Optimum reaction temperature for γ-GTP[PSc1784;S*6/7〗圖4γ-谷氨酰轉肽酶最適反應pH Figure 4The optimum reaction pH for γ-GTP[PSc1785;S*2〗圖5不同金屬離子對γ-谷氨酰轉肽酶酶活力的影響Figure 5Effects of various metal ions on the activity of γ-GTP
在一般情況下，適合的金屬離子及適合的濃度會對酶的催化活性產生促進作用，但如果反應體系中金屬離子濃度過高，反而會對酶蛋白產生毒害作用。為此，可選擇對γ-GTP影響較大的鎂離子研究濃度與酶活力的關系。
Mg2+濃度對酶活力的影響比較顯著。在低于3.0 mmol/L的濃度范圍內，酶活力隨著Mg2+濃度的增加而增高，當濃度達到3.0 mmol/L時酶活力最高，此后，酶活力隨著Mg2+濃度上升而緩慢下降。由此可見，在圖5所涉及的金屬離子(除亞錫離子外)雖然在5 mmol/L的濃度下對酶活力均有促進作用，但在不同濃度下有些金屬離子也會對酶起到抑制作用。見圖6�！ PSc1786;S*2〗圖6鎂離子濃度對γ-谷氨酰轉肽酶活力的影響Figure 6Effects of Mg2+ concentration on γ-GTP
3討論
地衣芽孢桿菌所產生的γ-GTP在25~35 ℃的溫度范圍有較好的穩定性，在50 ℃的溫度下保存20 min酶活力基本喪失，這為進一步利用該酶轉化生產茶氨酸時的溫度條件提供了依據。該酶對酸性環境無耐受性，適宜在堿性條件下保存，在pH低于11的堿性條件下保存30 min，酶活力基本無損失。利用γ-GTP生產茶氨酸需要反應體系pH 為10[9]，而該酶在此pH下比較穩定，說明地衣芽孢桿菌所產生的 γ-GTP適合于酶法轉化生產茶氨酸。
按照γ-GTP酶活力檢測方法得到地衣芽孢桿菌所產γ-GTP的最適反應溫度為45 ℃，最適合反應pH為8.0，在金屬離子濃度為5 mmol/L的情況下，鉀離子、鈣離子和鎂離子等金屬離子對酶的活力均無傷害，其中有些金屬離子(Mn2+,Ca2+)的存在對酶活力促進作用較大(見圖5)，在酶轉化生產茶氨酸選擇合適的離子濃度對酶活力的提高有較大的促進作用，如當鎂離子濃度為3.0 mmol/L時酶活力提高了55.9%。
本文僅對γ-谷氨酰轉肽酶的基礎酶學性質進行了初步研究，有關催化動力學常數，以及利用該酶生產茶氨酸的合適工藝條件還有待進一步的探討。
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