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青霉素結合蛋白研究進展
青霉素結合蛋白(PBPs)是廣泛存在于細菌表面的一種膜蛋白，是β_內酞胺類抗生素的主要作用靶位。不同細菌其種類及含量均不相同。但各種菌種的PBPs又有許多類似的結構與功能，在細菌生長、繁殖中發揮重要作用。PBPs結構與數量的改變是產生細菌耐的一個重要機制�，F今，各類抗生素雖種類繁多，但在耐藥菌的治療中仍缺乏有效手段。因此近年來圍繞PBPs開展了大量的研究工作，試圖從分子結構與基因水平認識PBPs，探求細菌耐藥的機制，企圖獲得更有效的治療手段。
1 PBPs研究簡史及基本概念
盡管上很早就開始應用青霉素，但到20世紀50年代，人們才認識到青霉素是通過干擾細菌的表面結構而起作用的。60年代，細菌細胞壁的結構被闡明，為人們認識青霉素作用機制及PBPs奠定了基礎。1972年Suginak . Blumberg和Stro minge:發現青霉素結合蛋白，用放射性同位素標記的青霉素可以標出細菌表面的PBPs，但后來的研究發現并非所有PBP均是青霉素作用的致命靶位。所有細菌都含有多種青霉素結合蛋白，不同菌屬其PBPs含量、種類各不相同，不同的抗生素通過與不同的PBP蛋白結合而產生不同的抗菌活性。因此，與不同PBP結合的抗生素可聯合應用，往往產生協同作用。
每個菌種都有一套特異的PBPs，稱PBPs譜。在一種菌種中PBPs按分子量大小排序，分別稱PBPI,PBP2,PBP3......。PBPl為分子量最大的一種。不同菌屬PBPs的生理功能很相近，而且分子結構上也有其相關及相似性。PBPs含量很少，僅占細胞膜蛋白總量的1%，不同PBP含量變化很大，如大腸桿菌中高分子的PBPI,PBP2和PBP3量很少，而低分子PBPS和PBP6卻占PBPs量的70%—90%。各種PBP與抗生素親和力相差亦很大。親和力大小一般用。表示; 指使-青霉素G結合減少50%時該抗生素濃度，其值越高，示藥物親和力越小。
研究PBPs的方法與技術不斷地發展。比如現已用分子生物學方法研究PBPs分子結構，基因構成與變異，通過基因重組研究PBPs功能等。但傳統的方法仍是研究的基本方法，比如用超聲技術粉碎細菌，離心分離胞膜，用Triton X-100從胞膜中分離PBP s ,用一青霉素G標記PBPs，用膠體電泳分離PBPs等。
2各種青霉素結合蛋白研究進展
PBPs在不同菌種中各不相同，但對其分子結構，生理功能的研究發現每種菌種均有特異PBPs,PBPs的生理功能直接影響與其結合的抗生素的抗菌活性，這方面的研究已積累了大量的資料.但某些問題及研究結果的意義仍不十分清楚，為了研究者能迅速了解這方面研究進展，以下以大腸桿菌和肺炎球菌為例說明研究近況。
對大腸桿菌PBPs的研究最早開展，也是研究最多的，比較具有代表性。大腸桿菌含6種PBP，依次為PBPI,PBP2,PBP3.PBP4,PBPS,PBP6。
大腸桿菌PBP1主要功能為維持細胞形態,可分成PBP1a,PBPlbs兩部分。PBPlbs主要分布于細胞內膜.亦有少部分分布于細胞外膜①。是細菌生長的重要蛋白，與抗生素結合可致細菌快速溶解.最近研究表明，PBP1b是一種球蛋白，具有2個密切相關的酶活性區，一為轉肚酶活性區(轉肚反應是細胞壁合成中的限速反應)，另一為轉糖酶活性區②。 PBPla具有PBPlbs替代酶的作用。缺乏PBPla的變異株能夠存活，說明PBPla為細菌生長非必需蛋白.用僅有PBPla,PBPlbs基因或特異性分裂基因ftsA, ftsQ,pbpB, ftsZ變異的細菌株來研究PBPa與PBP1 bs的功能時發現:PBPla不能獨立維持細胞完整性，需與PBP2,PBP3及ftsQ基因產物一起才能維持細菌存活.而PBPI bs顯然較PBPla有更強的生物合成功能，在缺乏PBP1a,PBP2,PBP3和f tsQ基因產物時變異株細菌仍能存活，在細菌分裂中，PBPlbs也起著相當作用，與膚聚糖的合成有關③④。
PBP2能維持大腸桿菌的張力，使菌體保持桿棒狀。PBP2僅占PBPs的1%。美西林、克拉維酸和硫霉素與PBP2有高度親和力。與PBP2結合后，可使細菌變成園球體，終致溶解、死亡。有實驗表明在缺乏PBP2基因的菌株中，如能使PPGPP大量表達及分裂蛋白ftsZ,ftsA, ftsQ大量表達，細菌仍能存活并分裂繁殖⑤
PBP3與細菌分裂有關。在DNA復制完成后PBP3被激活，并催化梭基膚酶反應，產生細菌分裂必需的肚聚糖合成反應。低濃度的頭抱菌素作用于PBP3使細菌成為絲狀體(細菌分裂受阻，菌體卻不斷延長)，但一般菌體并不溶解⑥。
大腸桿菌PBP4同時具有D , D-梭膚酶活性及D.D一內膚酶活性⑦。缺乏PBP4的變異株能很好地存活，因此PBP4并不是β一內酞胺類抗生素的主要作用靶位。對PBP4一級結構的研究發現，編碼PBP4主要活性部位的基因SXXK,SXN及KIG與A型件內酞胺酶是同源的⑧。在PBP4的SXXK與SXN之間有一區間，不同菌株PBP4氨基的順序可在這區間刪除不等量氨基酸，與原PBP4蛋白比較，分子量可從1%至79%不等，但對基本功能影響甚少⑨。
PBPS具梭基膚酶活性，缺乏PBPS的變異株對某些抗生素特別敏感，而且PBP5功能受PBP2影響。在缺乏PBP4與PEPS的變異株中，其功能可由PBP3完成。PBPS有膜型和游離型兩種，其中游離型可在細胞內形成結晶⑩。在PBP5梭基端有一約100個氨基酸的末端，切除此末端仍保留PBP5蛋白與青霉素結合能力及酶活性，但容易被蛋白酶降解，說明這個撥基末端具有穩定蛋白質的作用⑾。
PBP6不具梭基膚酶活性，但在細菌靜止期有穩定膚聚糖結構的作用。過量PBP6在胞漿內表達，可增加胞內胞膜小泡形成⑿。
肺炎球菌主要有6種PBP蛋白，分別為高分子的PBPla. PBP16, PBP2x, PBP2a,PBP2b及低分子的PBP3。在耐青霉素菌中，PBPs譜及PBP2b,PBP2x基因序列有較大差異。但敏感株PBPs譜卻十分類似⒀。用血清學分離的菌株中，同一血清型PBPs譜亦有變異.很少有PBPs譜完全相同的菌株。
用基因分析的方法研究肺炎球菌中P$P1a,26,2x發現去除PBP2x,26基因，細菌不能存活，而缺乏PBPla的菌株可以獲得，說明PBP2x, 26是細菌生長必需蛋白質。PBPla對細菌生長及對苯哇西林敏感性影響均不大⒁。
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PBP2x為肺炎球菌對頭抱唾肪敏感株的主要作用靶位，而在耐株中則成為數個靶位中的一個⒂ PBP2x具催化不同酷類及硫醇酷底物水解與轉膚反應.其催化活性與鏈霉菌R61的D.D-膚酶相似⒃�，F已能應用基因工程合成PBP2x水溶性衍生物，且在時可得到結晶。該結晶能阻斷頭抱菌素衍生物的生色反應，說明此結晶具有酶活性⒄。肺炎球菌對青霉素耐藥都由于出現高分子PBP2x基因，耐藥菌與敏感菌比較，耐藥株基因變異大。因基因變異起源于不同菌株間基因重組，就象PBP2b一樣，耐藥株PBP2x基因轉移了使敏感株轉變為耐藥株⒅⒆.
PBP3為D,D-梭膚酶，對細菌胞膜性質影響很大。PBP3含量減少可使細菌對高溫、甘氨酸及一些D-氮基酸特別敏感，且可使細菌對頭抱唾肘產生耐藥}⒇, PBP3的氨基酸序列與大腸桿菌PBPS,PBP6及枯草桿菌PEPS非常相似。PBP3以C端定位于胞膜.缺乏PBP3的細菌成不規則形態，體積增大，分裂嚴重受阻。在胞內多部位出現異常中隔，并產生厚薄不一的胞壁。
3不同PBP與卜內酞胺類結合能力及卜內酸胺類的聯用
各種抗生素與PBP3親和力均不同，因此抗菌活性亦不同。作用于不同PBP的壓內酞胺類在聯用時可產生協同作用。不同PBP與抗生素親和力用玩表示(表1-3)。
美西林、克拉維酸可特異地與PBP2結合，多種青霉素、頭飽菌素與PBPla親和力較高。頭飽拉定、頭抱哇林與PBP 1b親和力高。頭飽氨節、氨曲南、furazolocillin與PBP6親和力較高.許多抗生素與PBPlbs及PBP3結合力往往有較大差異，因此聯用時往往可產生協同效應。
美西林由于其特異地作用于PBP2，與較多作用于PBPI.PBP3的抗生素可產生協同作用，已證實其與氮節西林、阿莫西林、狡節西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、呱拉西林、頭抱唾吩、頭泡哇林、頭抱氨節、頭抱拉定‘、頭飽孟多、頭飽西丁均呈協同抗菌作用⑥。
克拉維酸亦是特異地與PBP2結合，其與件內酞胺類的協同作用是公認的，但由于克拉維酸是A-內酞胺酶的抑制劑，因此協同作用可由此特性而產生。但有人發現克拉維酸與卜內酞胺類合用在一些不產酶菌中亦有協同表現，這就與其特異性結合PBP2相關(表4)。
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這方面研究資料并不太多，但如果我們能切實找到與PBP作用點相應的抗生素，那么這在聯合用上將是有效的。
4 PBPs譜變異與耐藥性產生
PBPs譜包括PBP種類及其百分含量.由于不同菌株的PBP譜有其特異性，現已成為細菌的一種分類方式。PBPs為抗生素的作用靶位，按此分類有助于對細菌耐藥性的推測及估價。人們認識到PBPs譜的變異與細菌耐藥性密切相關。
分離耐亞胺培南的不動桿菌，其PBPs與青霉素的結合能力下降，該菌株不產生卜內酥胺酶，其耐藥性主要同PBPs蛋白變異所致，比較腸球菌的PBPs發現，25株中13株具附加77kDa PBP(PBP6')，而其它菌株均有52kDa PBP (PBP7)和46kDa PBP<PBPB),PBP6與青霉素敏感性關系不大，但PBP7與細菌耐藥性卻密切相關。對耐青霉素奈瑟球菌的研究亦發現PBP2結構改變，且其與抗生素的結合能力下降。PBP2基因譜中，耐藥菌株與敏感菌株僅在一個175bp基因段差異較大。肺炎鏈球菌耐藥株中PBPs基因轉移至敏感株可使敏感株變為耐藥株。
5耐藥基因溯源
關于耐藥基因來源問題分歧很多，有人認為可通過基因突變，還有人認為是通過不同菌株間的基因轉移�，F在又有人實驗發現了一個有趣的現象。在諾卡菌產生頭霉素基因中含3種基因片段:一為典型的編碼卜內酞胺酶基因;一為編碼PBP基因;另一為編碼穿透胞膜蛋白基因，諾卡菌的各內酞胺酶與臨床分離細菌中A型(β-內酞胺酶十分相似，此a-內酞胺酶對青霉素有活性，但對頭霉素無作用，在諾卡菌中有8種PBPs，無一與頭霉素結合，另一胞膜蛋白與抗生素合成及分泌的控制有關.其抗生素、卜內酞胺酶與PBPs產生均保持平衡，是其存活的條件在該實驗中，可以看到在一個產生抗生素的微生物中，存在制衡現象.整個微生物界亦如生物圈一樣存在生存的競爭及制衡現象，我們應用抗生素也正是利用了微生物界的這種制衡關系。但耐藥基因是否亦是由此而來，即產抗生素的菌對敏感菌高度抑制使其表現為“失衡”而敏感菌從產抗生素的菌株得到耐藥基因再次出現制衡，這是一個有趣而耐人尋味的問題.在控制耐藥菌感染中，能否再次利用這種現象，以提供有效的治療手段是值得探索的。
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