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大黃對慢性腎功能不全大鼠保護機制的研究
【摘 要】 目的 觀察大黃對慢性腎功能不全大鼠腎功能及腎組織TGF-β1和smad7表達的影響。方法 采用腺嘌呤法建立大鼠慢性腎功能不全模型，治療組予以大黃(4 g/kg/d)灌胃。治療4 周后，檢測各組大鼠的24 小時尿蛋白定量、腎功能，通過組織學及蛋白印記觀察腎組織TGF-β1和smad7的表達。結果 治療組大鼠的24h尿蛋白定量、腎功能明顯增加(P<0.01)，而治療組大鼠24 h尿蛋白定量、腎功能較非治療組減少(P<0.05)。非治療組大鼠腎組織TGF-β1、smad7表達較正常組明顯增加(P<0.01)。結論 大黃可降低慢性腎功能不全大鼠24 小時尿蛋白、腎功能水平，抑制腎組織TGF-β1和smad7表達。大黃對慢性腎功能不全的保護機制可能與降低腎臟TGF-β1和smad7表達有關。
【關鍵詞】 大黃;慢性腎功能不全;腺嘌呤;轉化生長因子-β1;smad
[Abstract] Objective To study the effect of Dai Huang on glomerulosclerosis and expression of TGF-β1 and smad7 in rats with CRF. Methods Rats were divided into control group, not treated group and Dai Huang treated group with 20 rats in each group. The rats in the latter two groups were intragastric of Adenine. the treated group was fed with Dai Huang at a dose of 4g/(kg·d) for 4 weeks. Urine protein excretion, urea nitrogen and creatinine was measured. The expression of TGF-β1 and Smad7was measured. Results Compared with the control group, the not treated group showed higher urine protein excretion, urea nitrogen, creatinine(P<0.01)and expression of TGF-β1 and smad7. Conclusion Dai Huang can diminish urine protein excretion and prevent glomerulosclerosis in subtotally nephrectomized rats. This protective effect is presumed to be associated with its effect on expression of TGF-β1 and Smad7.
[Keywords] Dai Huang; Chronic renal failure; Adenine; TGF-β1; Smad7
大黃為蓼科植物掌葉大黃，現代藥理學研究發現，大黃有抗血小板聚集、降血脂、清除氧自由基、提升超氧化物歧化酶(SOD)的活性，減輕免疫炎癥反應的功效，同事具有瀉熱通便、解毒消癰、行瘀通經功效。我們通過觀察大黃對慢性腎功能不全大鼠的治療，觀察其對尿蛋白排泄、腎功能的影響;并觀察其對腎組織中轉化生長因子β1(TGF-β1)、smad7的蛋白表達及腎臟病理變化的影響，探討大黃對慢性腎功能不全的療效及作用機制。
1 材料與方法
1.1 材料
湖北產中藥材大黃。腺嘌呤(產品批號2007109)。兔抗TGF-β1、Smad7抗體;En Vision免疫組化試劑盒;BCA試劑盒。
1.2 實驗動物分組和模型建立
雄性SD大鼠60 只，7 周齡，體重190±20 g。適應性飼養1 周，隨機分為正常組20 只和腺嘌呤組40只。腺嘌呤組每日腺嘌呤300 mg/kg灌胃，6 周后以代謝籠留取24 小時尿液，眶內靜脈采血，測定24 小時尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐。檢測發現全部造模成功。隨機分為2 組：非治療組20 只，治療組20 只。治療組大鼠每日給予黃葵膠囊[2 g/kg·d]灌胃，同時正常組和非治療組給予等量生理鹽水灌胃。4周后全部大鼠以代謝籠留取24 小時尿液，眶內靜脈采血，測定24 小時尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐。大鼠處死后取部分腎組織置于10%中性甲醛中固定，部分腎組織液氮保存用于蛋白印跡雜交方法(Western blot)檢測蛋白表達。實驗期間大鼠自由飲水、進食。
1.3 檢測方法
1.3.1 尿蛋白定量及腎功能測定
1.3.2 病理形態學觀察
腎組織經10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸臘、包埋、切片，厚3 µm，行HE染色，觀察腎小球硬化及腎間質纖維化的程度。
1.3.3 蛋白印記分析
各組取約100 mg腎組織置于1 ml裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑PMSF 100ug/ul，aprotinin 1 ug/ml，leupeptin 1 ug/ml)，勻漿后冰浴30 分鐘，然后4 度12000 g離心20 分鐘。提取蛋白后用BCA法測量蛋白濃度。取等量蛋白質進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉移至聚氟乙烯膜上，封閉液封閉，加入1：200稀釋的 TGF-β1抗體，4 ℃過夜。0.05%TBST洗膜3 次，ECL顯影。
1.4 統計學處理
計量資料采用均數±標準差表示，數據用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理。各組間均數比較采用單因素方差分析，P <0.05認為有統計學意義(方差齊時用LSD法、方差不齊時用Tamhane法)。
2 結果
2.1 尿蛋白定量變化
非治療組和治療組大鼠尿蛋白排泄明顯高于正常組(P <0.01);治療組大鼠尿蛋白定量與非治療組比較有所降低(P <0.05)，見表1。
2.2 血清生化指標變化
非治療組和治療組大鼠血肌酐明顯高于正常組(P <0.01);治療組大鼠血肌酐與非治療組比較有所降低(P <0.05);尿素氮變化同血肌酐變化，見表1。
表1 各組大鼠尿蛋白定量、血尿素氮、肌酐水平( )
組別 n 尿蛋白定量(mg/d) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(µmol/L)
正常組 20 9.24±2.16 7.26±1.03 48.26±9.36
非治療組 20 169.36±27.69* 18.57±3.89* 119.41±15.86*
治療組 20 89.1±17.34*▲ 14.18±5.34*▲ 80.64±12.25*▲
*與正常組相比，P<0.01，▲與非治療組相比，P<0.05。
2.3 組織病理學改變
在HE染色中，非治療組大鼠可見明顯的腎小球增生，系膜增殖，腎小球毛細血管部分塌陷，球囊粘連，部分腎小球完全硬化，間質有炎細胞浸潤，部分腎小管已萎縮，系膜外基質顯著增加(圖1)。治療組與非治療組比較，腎小球損傷、硬化輕，腎間質炎細胞浸潤少，間質纖維化。
2.4 腎組織TGF-β1和smad7用蛋白印記方法檢測結果
治療組和非治療組大鼠相比TGF-β1表達下調，而smad7表達上調。見圖2。
3 討論
慢性腎功能不全是所有腎臟疾病進展的共同結局，其實質是腎臟纖維化，嚴重威脅人類健康。目前研究表明，TGF-β1和其受體下游的信號轉導因子Smad7蛋白在促進腎小球纖維化及腎小管間質纖維化方面起重要作用。
TGF-β1 是迄今已知作用最強的一種促腎纖維化的細胞因子，具有調節細胞的增殖、分泌、遷移和凋亡等多種生物學活性。TGF-β1在腎纖維化中的作用涉及到細胞外基 (ECM)、細胞增殖及轉分化、炎癥浸潤等各個環節，是介導腎小球硬化和腎間質纖維化關鍵細胞因子，在腎纖維化過程中TGF-β1起著關鍵作用[2]。
正常組 非治療組 治療組
圖2 Western blot檢測各組大鼠TGF-β1和smad7蛋白表達結果
目前認為，Smad7主要通過與TGF-β1型受體結合抑制TGF-β1信號轉導，以往在許多腎臟疾病如腎小球腎炎、腎病綜合征、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等的動物模型和人的腎活檢標本的研究中，都提示TGFβ1/Smad7信號通路被激活，用抗TGF-β1的抗體或Smad7轉基因治療時，慢性腎臟病的腎臟纖維化得到改善，提示Smad7信號通路在腎臟纖維化的發生發展中起著重要作用[3]。
現代實驗表明大黃能抑制TGF—β1的過度表達，減緩腎功能惡化速度，而被被廣泛用于治療慢性腎小球腎炎和慢性腎衰竭[4]。慢性腎功能不全的實質是腎臟纖維化，而TGF-β1是促腎纖維化最重要的細胞因子，smad7 蛋白是TGF-β1受體的胞內激酶底物，在調節TGF-β1促腎纖維化過程中起重要作用，本實驗結果顯示大黃可能通過減少腺嘌呤致慢性腎功能不全大鼠的 TGF-β1及增加smad7蛋白表達，來減緩甚至抑制腎小球及腎間質纖維化;降低大鼠24 小時尿蛋白定量、血尿素氮及血肌酐;減輕慢性腎功能不全大鼠腎病組織的病理改變，延緩慢性腎功不全進入終末期腎衰竭的時間。
參考文獻
[1] Wang W, Koka V, Lan HY. Et al. Transforming growth factor-beta and Smad signalling in kidney diseases[J]. Nephmlogy(Carlton),2005,10(1):48-56.
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[3] Hirotaka Fukasawa.Tatsuo Yamamoto. Treatment with anti-TGF-β1antibody ameliorates chronic progressive nephritis by inhibiting Smad/TGF-β1 signaling[J].Kidney International,2004,65:63-74.
[4] 張冉,許旭東. 大黃灌腸對慢性腎衰竭患者轉化生長因子-β1及腎功能的影響[J].中國中西醫結合腎病雜志,2008, 9(3):263-264.
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