人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)及操作程序
H7N9亞型禽流感病毒是甲型流感中的一種。2013年3月底，在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)3人感染H7N9禽流感病例。H7N9型禽流感是全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流感病毒，尚未納入我國法定報(bào)告?zhèn)魅静”O(jiān)測報(bào)告系統(tǒng)，并且也尚未有疫苗推出。被該病毒感染均在早期出現(xiàn)發(fā)熱等癥狀。下面是yjbys小編為大家?guī)淼娜烁腥綡7N9禽流感病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)及操作程序的知識，歡迎閱讀。
一、目的
確保人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測過程標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，降低人為不規(guī)范操作對檢測結(jié)果造成的影響，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
二、適用范圍
醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室按照《關(guān)于醫(yī)院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測有關(guān)工作的通知》(衛(wèi)辦醫(yī)政函〔2013〕383號)和《關(guān)于做好醫(yī)療機(jī)構(gòu)人感染H7N9禽流感檢測試劑供給保障工作的通知》(衛(wèi)發(fā)明電〔2013〕29號)有關(guān)要求，使用國家疾病預(yù)防控制中心制備或商品化試劑盒開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作。
三、樣本采集、運(yùn)送和保存
1、盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道樣本(上呼吸道樣本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道樣本包括痰液、氣管吸取物、肺洗液、肺組織等)�？蓪⒈恰⒀适米邮占谕徊蓸庸苤�，以便提高檢出率�；颊哂邢潞粑罉颖緯r，應(yīng)優(yōu)先采集。
2、根據(jù)試劑說明書對樣本采集方法有關(guān)要求，制訂樣本采集標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，并組織樣本采集人員進(jìn)行培訓(xùn)及考核。樣本的采集應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行。
3、樣本采集后，按照《人間傳染病的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行包裝，用密封容器立即送往實(shí)驗(yàn)室。若氣溫高時，需放入冰塊降溫。樣本抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)盡快進(jìn)行檢測，24小時內(nèi)能檢測的樣本可置于2～8℃暫時保存，24小時內(nèi)無法檢測的樣本則應(yīng)置于≤-70℃狀態(tài)保存。如無-70℃保存條件時，可于-20℃冰箱暫存。樣本避免反復(fù)凍融。
4、樣本采集、處理、運(yùn)輸及保存不當(dāng)時，可因病毒RNA降解出現(xiàn)假陰性結(jié)果，也可因?yàn)闃颖?ldquo;污染”出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
四、PCR檢測
(一)樣本處理
樣本的核酸提取應(yīng)當(dāng)在樣本處理區(qū)進(jìn)行。按所采用的商品化試劑盒說明書要求，取適量待檢樣本、陽性及陰性對照進(jìn)行核酸提取。樣本應(yīng)盡可能新鮮，提取過程應(yīng)嚴(yán)防RNA酶污染及操作不當(dāng)導(dǎo)致的RNA降解。提取過程如涉及離心步驟，應(yīng)采用低溫冷凍離心機(jī);在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行加樣、提取過程中，為防止RNA降解，可將試管架置于托盤內(nèi)平鋪的碎冰上。提取好的RNA應(yīng)及時用于檢測，否則應(yīng)當(dāng)-70℃保存。如無-70℃保存條件，可于-20℃冰箱暫存。
(二)試劑準(zhǔn)備
試劑準(zhǔn)備應(yīng)當(dāng)在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。根據(jù)所用的試劑盒，樣本可進(jìn)行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亞型或H7N9病毒核酸的檢測。試劑的配制按所用商品化試劑盒說明書進(jìn)行。除酶混合物外，其它試劑在使用前應(yīng)當(dāng)在室溫充分復(fù)融，混勻并瞬時低速離心。反應(yīng)液分裝時盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免管內(nèi)溶液泄露污染儀器。分裝有擴(kuò)增反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)當(dāng)扣蓋或裝入密實(shí)袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
(三)加樣
加樣應(yīng)當(dāng)在樣本處理區(qū)進(jìn)行。加樣時應(yīng)當(dāng)使樣品完全落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。
按試劑、儀器說明書完成加樣和PCR反應(yīng)管準(zhǔn)備。
(四)PCR擴(kuò)增檢測
PCR擴(kuò)增檢測在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。待檢PCR管轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，按試劑和儀器說明書設(shè)定循環(huán)參數(shù)。
(五)結(jié)果分析
根據(jù)所用試劑盒說明書設(shè)置基線值(baseline)。熒光閾值(threshold)設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對照品擴(kuò)增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點(diǎn)為原則，且Ct值應(yīng)大于所設(shè)置的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(或顯示為undet)。使用儀器配套軟件自動分析結(jié)果。
(六)質(zhì)量控制
檢測過程對可能出現(xiàn)的假陽性和假陰性進(jìn)行質(zhì)量控制，除了檢測商品試劑盒所提供陽性和陰性對照外，每次臨床樣本檢測時，至少應(yīng)當(dāng)有1份弱陽性和3份陰性質(zhì)控樣本(多份陰性質(zhì)控樣本設(shè)置對實(shí)驗(yàn)室“污染”所致假陽性的'監(jiān)控更為有效)，隨機(jī)放在所檢測標(biāo)本的中間。弱陽性質(zhì)控樣本可為檢測陽性的滅活稀釋后保存的臨床樣本、滅活病毒或假病毒顆粒等，如所采用的商品化試劑盒有“內(nèi)標(biāo)”控制假陰性，或弱陽性質(zhì)控樣本來源困難，可暫不設(shè)弱陽性質(zhì)控。陰性質(zhì)控樣本采用標(biāo)本采集管內(nèi)溶液即可。質(zhì)控樣本應(yīng)與臨床標(biāo)本同等對待，參與樣本核酸提取和擴(kuò)增檢測全過程。
試劑盒中的陽性和陰性對照用于判斷實(shí)驗(yàn)室的有效性，按試劑盒說明書進(jìn)行。
(七)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定與解釋。
按照試劑盒說明書進(jìn)行。對于出現(xiàn)弱陽性結(jié)果的樣本應(yīng)進(jìn)行重復(fù)檢測，并注意與可能的實(shí)驗(yàn)室輕度或樣本交叉“污染”所致假陽性結(jié)果區(qū)別。
五、檢測結(jié)果報(bào)告
按照試劑盒說明書進(jìn)行。
六、其它注意事項(xiàng)
(一)人感染H7N9禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室活動、樣本采集和運(yùn)輸按照《人間傳染的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒進(jìn)行管理。從事人感染禽流感檢測的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)并具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能，在檢測過程中必須采取生物安全防護(hù)措施(使用眼罩、N95型口罩等)。樣本核酸提取必須在Ⅱ級生物安全實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過年檢合格的二級生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有良好的通風(fēng)。
(二)注意儀器設(shè)備的日常和定期維護(hù)，加樣器、擴(kuò)增儀和溫育設(shè)備應(yīng)進(jìn)行定期校準(zhǔn)。試劑盒及一次性使用的無DNA酶和RNA酶PCR反應(yīng)管、離心管、帶濾芯吸頭等應(yīng)進(jìn)行每批質(zhì)檢。
(三)實(shí)驗(yàn)應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作;各區(qū)物品、工作服等均應(yīng)當(dāng)專區(qū)專用，不得交叉使用。實(shí)驗(yàn)后應(yīng)及時清潔工作臺，以防污染。
(四)每批實(shí)驗(yàn)室后，可采取實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)、10%次氯酸鈉溶液擦洗地臺面、紫外照射等措施，消除可能存在的擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染。
(五)使用中國疾控中心制備試劑開展檢測工作時，可參考相應(yīng)試劑盒說明書有關(guān)要求
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