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檢驗技師考點:多克隆抗體的純化
多抗的純化是一件比較簡單的事情,因為人工干預比較大,所以對實驗者的操作依賴性較強。很多新手覺得這是一件比較復雜困難的工作,但是如果理解了原理,就可以自行改進實驗了。多抗純化方法比較多,過去有用鹽析法純化的,有用辛酸-硫酸銨沉淀的方式純化的,也有用冷酒精沉淀的方式純化的,也有后來的離子交換層析和Protein A,G,A/G純化的,但是在今天,市場上幾乎所有的抗體都是通過抗原親和純化得到的,與其它方法相比,抗原親和層析得到的抗體效率高、產量高、產品純、操作簡單。
操作方法:
免疫方法
可以采用以下各種方法之一進行免疫。
(1)淋巴結注射法:①在兔的兩后足跖部皮下(或皮內)注射活卡介苗 50mg(每側約0.30ml) 。7~10 天后,兔跖及腘肌淋巴結腫大;②于腫大的兩側淋巴結內各注射加有完全佐劑的IgG 乳化抗原 0.50ml(含 IgG 5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、鏈霉素 1 000μg/ml);③必要時,14 天后,重復步驟②一次;④再過 7 天后,于兩側淋巴結內各注射加有完全佐劑的 IgG 乳化抗原0.50ml(含IgG5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、鏈霉素 1 000μg/ml) ;⑤5~7天后,耳靜脈采血。測定血清效價。
(2)皮下多點注射法:①家兔兩側掌(跖內各注射含有完全佐劑抗原 0.10ml(IgG 含量5mg/ml) ;②7~10 天后,脊柱兩側多點(頸、胸、腰椎各兩點、共 6 點)皮下注射含不完全佐劑5的抗原,每點 0.50ml;③7~10 天后,脊柱兩側重復注射一次;④7~10 天后試血。不合格者重復步驟③。
(3)多途徑聯合注射法:①兩側掌(跖)內側皮下注射含完全佐劑抗原 0.50ml(IgG 量為 5mg/ml) ;②14 天后,多點皮下注射含有不完全佐劑抗原;③7 天后,耳靜脈注射不含佐劑的抗原 2ml;④測定血清抗體效價,不合格者重復步驟③,并適當遞增 IgG 量。
效價測定
采用瓊脂擴散法。
、 將血清倍比稀釋,加入外周孔。
⑵ 中間孔加動物 Ig。
、 37℃濕盒瓊擴 24 小時,觀察結果。
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