- 相關推薦
納米材料在蛋白磷酸化分析中的應用論文
蛋白質是生理功能的執行者，是生命物質的基礎，對蛋白質結構和功能的研究是生命科學研究中的重點。翻譯后修飾是調節蛋白質功能的重要方式，對其的研究對于闡明蛋白質的功能具有重要作用。蛋白磷酸化是蛋白質翻譯后修飾的一種，是在ATP存在下，通過蛋白激酶催化ATP 位的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸上的過程。其在胚胎發育、細胞增殖、新陳代謝、細胞信號傳導方面具有重要的調節作用，是生物體中常見的調節方式。當其調節發生異常時，會導致癌癥、心臟病等疾病的發生。因此，對蛋白磷酸化的研究有助于更好地了解細胞的信號通路過程，有利于疾病的診斷和治療。然而，由于磷酸化膚段在生物樣品中的含量較低且易受到非磷酸化膚段的干擾等主要缺點的存在，為檢測工作帶來很大的困難。因此，克服以上瓶頸和困難，實現蛋白磷酸化的高靈敏檢測，對于疾病早期快速診斷具有非常重要的意義。目前，蛋白磷酸化的檢測方法主要有：放射性檢測、熒光法、表面等離子體共振、質譜、電化學、WesternBlot及ELISA等。近年來，隨著納米技術的快速發展，將納米技術運用于蛋白磷酸化的高靈敏分析受到越來越多的重視。
納米材料按照結構可分為：零維納米材料（包括金屬納米粒子、量子點和磁性納米粒子等）、一維納米材料（如碳納米管等）、二維納米材料（典型代表是石墨烯）。因納米材料大的比表面積、豐富的鍵合位點、良好的生物相容性和催化活性以及獨特的結構，為高靈敏、高選擇性生物分析提供了動力，在DNA分析酶傳感、生物小分子的檢測等領域被廣泛應用，同時也為蛋白磷酸化分析帶來新的機遇。
本文基于選擇性識別或捕獲磷酸化的膚段或蛋白的主要機理，綜述了近幾年納米材料在磷酸化膚段的富集和信號放大方面的應用，及其在高靈敏蛋白磷酸化分析中的研究進展并進行了展望。
1磷酸化膚段或蛋白的富集及信號放大機理
1。 1基于納米材料的富集機理
為排除非磷酸化的膚段或蛋白的干擾，選擇性識別或捕獲磷酸化的膚段或蛋白是非常重要的一步。利用納米材料選擇性富集磷酸化的多膚或蛋白的常見方式是通過化學親和作用，一種是采用金屬氧化物作親和探針，其中金屬氧化物的路易斯酸度是影響金屬氧化物親和性的主要因素
①具有最強酸度的金屬氧化物，因可與非磷酸化多膚鍵合，致使檢測存在著很嚴重的非特異干擾。
�、诰哂休^強酸度的金屬氧化物對磷酸化膚存在強的鍵合力，因為多磷酸化膚不易洗脫，致使優先檢測單磷酸的多膚。
③具有較低酸度的金屬氧化物因與單磷酸化膚弱的相互作用，可選擇性地親和多磷酸化的膚。另一種是金屬離子與磷酸根的作用。關于金屬離子與磷酸根的相互作用存在著爭議，有文獻認為金屬離子與磷酸根是靜電吸附作用，而有的文獻則認為它們之間作用力的強度遠大于靜電作用。
1。 2基于納米材料的信號放大機理
近幾年，信號放大技術尤其是基于納米材料的信號放大在磷酸化的超靈敏檢測中受到了廣泛關注。如何既能選擇性識別磷酸化膚段或蛋白，又能結合信號放大部分，以實現磷酸化膚段或蛋白檢測信號的放大是其關鍵步驟。較常用的識別或連接方式主要有兩類：①生物親和作用，②化學鍵合作用。而基于納米材料信號放大的機理主要歸于以下兩個方面：①納米材料作載體。因為納米材料獨特的生物相容性和大的比表面積以及易于修飾的特性，使其非常有利于用作載體以增強探針的量。通常納米材料作為一個基底元素用來富集目標分子或信號分子，以實現信號的放大。②增強導電性。一般納米材料的導電性比較優越，因此可加快電子傳遞的速率，提高信號響應。
2基于納米材料對磷酸化膚段或蛋白的預富集
由于非磷酸化多膚的干擾和磷酸化多膚本身的豐度低等問題，導致研究者對蛋白磷酸化位點的鑒定和分析存在很大的困難。因此，對磷酸化的膚段或蛋白進行選擇性富集，以提高磷酸化組分的相對含量，降低非磷酸化組分的干擾顯得十分重要。納米材料及其復合物因為價格低，納米表面易于功能化，與磷酸化膚之間的結合力強，而被廣泛用于蛋白磷酸化的富集和分離。
2。 1介孔納米材料
近幾年，介孔材料在納米科學領域中占據重要的地位，基于其獨特的微納米尺寸效應，如大的比表面積、多孔結構等，介孔材料被應用于不同的生物領域。
金屬氧化物納米粒子因獨特的表面效應、超順磁性、小尺寸效應和量子隧道效應等特性，使其表面易于富集磷酸化多膚。早期的研究主要是將單一的納米金屬氧化物填充在柱體中或移液器吸頭內進行磷酸化膚段的預富集。2009年，Ge等首次將制備的介孔二氧化錯納米材料用于高效選擇性富集磷酸化的膚段。與納米金屬氧化物材料相比，介孔納米材料因其超大比表面積以及許多活性位點，而具有更強的鍵合磷酸根的能力。隨后，介孔二氧化欽和介孔二氧化鉛納米材料也被用于磷酸化膚的富集。研究表明，介孔二氧化鉛和二氧化錯在復雜樣品中富集磷酸化膚段的能力優于介孔二氧化欽納米材料。雖然，介孔金屬氧化物納米材料在富集磷酸化多膚方面優于金屬氧化物材料，但其過深的孔道結構可能導致目標多膚富集和釋放困難。
在己報道的富集技術中更傾向于單磷酸化膚段的富集，而導致多磷酸化膚段的信息丟失，不利于對其全面的了解和研究。針對這個問題。用ZrP修飾的介孔硅材料選擇性捕獲磷酸化的膚段并運用質譜進行分析。該材料因表面與多磷酸化膚段的結合力更強而優先富集多磷酸化的膚段。劉寶紅課題組也將功能化的介孔材料應用于多磷酸化膚的富集，發展了新型的針對多磷酸化膚段的富集方法，該研究組用濕潤注入法在硅介孔材料表面修飾二氧化欽，制備了一種基于二氧化欽修飾的介孔硅材料。介孔材料大的比表面積及其良好的微納尺寸效應，加快了溶液體系中介孔材料和多膚之間的吸附。同時又因為二氧化欽修飾于介孔材料之后，在其表面形成大量的不飽和的4配位欽物種，易與磷酸基團形成雙齒鰲合，且更傾向于發生在多磷酸化膚段中，使多磷酸化膚段優先選擇吸附，檢測信號顯著提高。該研究組還構建了一種微納反應器，先制備大孔有序的氧化鋁功能化的氧化硅泡沫材料，然后將蛋白酶固定在該泡沫材料上，該反應器己被應用于磷酸化多膚的分析。具有大的孔徑和比表面積，既可實現原位酶解又可發生原位磷酸化。將A1 — MOSF直接加入到溶液中時，酶和蛋白質會迅速富集到孔穴中以達到蛋白質的快速水解，同時又吸附固定磷酸化的多膚在其孔穴中，而非特異性的膚段被釋放到溶液中。該方法簡單、有效，己被成功應用于實際樣品的檢測。但以上方法存在一定的局限性，如修飾的金屬氧化物不能完全覆蓋硅基底材料，致使其富集過程受到影響。
2。 2磁性納米材料
為了簡單快速有效地實現分離富集，研究者又將具有磁性的鐵氧化物材料引入其中。利用不同的鐵氧化物表面包覆一層TiOZ或AlZ03，用于磷酸化膚段的富集并檢測。研究表明，由于通過TiOZ包覆的磁性粒子對樣品進行富集后，一些非磷酸化的膚段在譜線中出現，從而對磷酸化膚段的檢測產生了干擾Czi —zzl，因此，AlZ 03包覆的磁性粒子對磷酸化膚的選擇性優于TiOZ包覆的磁性粒子。在合成方法中，核殼技術也越來越多的引起人們的關注。X等利用水熱反應首先合成了Fe 3 0、微球，隨后通過葡萄糖的聚合作用和碳化作用使其表面包覆一層碳，制備了具有核殼結構的Fe304。在此基礎上，制備了介孔核殼結構的磁性納米復合物，應用于磷酸化多膚的分析中，具有高效、特異識別以及低分子膚段丟失量小的特點Czal 金屬離子修飾的細菌性磁性納米粒子（BMPs）可用于快速富集檢測磷酸化的膚段。其中修飾的BMPs優先富集單磷酸化的膚段，而Zr4修飾的BMPs則優先富集多磷酸化的膚。 2013年，Wang等首次合成了磁性介孔納米晶體簇，無需任何修飾直接用于磷酸化膚段的有效富集。該磁性介孔納米晶體簇具有優秀的磁性響應（與之前的磁性復合物相比，磁性分離響應時間少于5s）、超高的選擇性、較高的富集回收率（高于89。4% ）、優秀的富集速度（10 min便可完全富集）等特點。該材料己成功應用于實際樣品的檢測。
熒光方法因操作簡單、易讀、高產、樣品量少等獨特的優勢，近年來在磷酸化富集檢測中也有相關應用。制備Zr4功能化的磁性納米粒子用于選擇性捕獲磷酸化的具有熒光標記的膚段，然后運用磁性分離富集，依據溶液中的熒光強度的改變，對磷酸化的膚段進行分析，利用該材料研究了在不同含量的藥物刺激下，MCF 7細胞裂解液中蛋白激酶的表達水平。近期，Liu等制備了TiOZ修飾的磁性微球用于富集磷酸化的膚，與其它熒光方法相比，該材料展現出超高的熒光信號變化（S IN = 42 ），檢出限低至0。 1U/mL。采用熒光方法結合磁性納米材料富集目標多膚，具有靈敏度高、重現性好等優勢，但同時也存在需要對底物進行較為復雜的熒光修飾等缺點。
2。 3碳納米材料
在磷酸化多膚的富集過程中，早期主要用CIA硅膠柱和C — 60共價鍵合的二氧化硅進行預富集隨后，碳微球因其良好的導電性、豐富的官能團和熱力學穩定性等被廣泛應用到磷酸化多膚的富集中。其中包括TiOZ功能化的膠質微球和TiOZ修飾的磁性石墨碳球等。
近期，基于一維碳納米材料碳納米管和二維的石墨烯在磷酸化多膚的富集和分離方面的研究引起了廣泛關注。Fang等首次將TiOZ—MWNT納米復合物用于磷酸化多膚的富集和分離，該納米復合物還成功應用于實際樣品脫脂牛奶水解液中磷酸化多膚的富集。這主要歸功于MWNT大的比表面積、易吸附疏水性物質和TiOZ與磷酸化多膚的專一作用。另外，兩者的復合還避免了單一TiOZ納米粒子的聚沉等問題。與碳納米管相比，石墨烯是新發現的具有二維結構的材料，其共扼結構大、電子傳輸能力強、合成原料價格低廉等優勢，使得石墨烯及其衍生物的應用研究成為熱點。金屬氧化物納米粒子功能化的石墨烯復合物既結合了金屬納米粒子的特性又繼承了石墨烯的優勢，在磷酸化分析中具有很強的吸引力。但合成的碳納米材料一金屬親和材料中，金屬納米材料的比表面積可能無單一納米微球的比表面積大，致使其選擇性不太理想。
3基于納米材料的信號放大作用
高靈敏度在發展新型生物分析方法中己成為主要目標，為了滿足對超靈敏生物傳感器的需求和符合微型化生物分析的發展趨勢，信號放大技術在近幾年引起了人們的廣泛關注。如，基于納米材料的信號放大，基于酶的信號放大，以及基于核酸的信號放大技術等。在這些方法中，納米材料因具有加快信號傳導和提高位點的識別作用而在信號放大技術中得到廣泛應用。本文主要綜述了基于三類納米材料的信號放大在蛋白磷酸化分析中的研究進展。
3。 1基于金屬納米粒子
金屬納米粒子因具有良好的光學、電化學和催化特性，己成為生物傳感器中一類很有吸引力的材料，近年來對于金屬納米材料的研究也在不斷地推進。其中基于金納米粒子和銀納米粒子的信號放大在蛋白磷酸化分析方面效果尤為顯著。
AuNPs的合成非常簡單，用氯金酸作還原劑，在快速攪拌的條件下可合成粒徑大小均一的Au納米粒子，形成穩定分散的膠體溶液。合成的AuNPs具有很多良好的特性，在蛋白磷酸化分析中可直接用于信號放大。Kim等用半肌氨酸修飾的多膚與AuNP、共價鍵合，使多膚固定在AuNP、的表面，利用AuNPs既可作目標分子富集器，又可作信號增強器的特性，采用二次離子質譜成像法成功地用于蛋白激酶活性的無標記分析。Kerman等利用生物素與親和素的專一作用將AuNP、組裝到電極上，以AuNPs為標記并通過其氧化還原信號實現磷酸激酶活性的分析。隨后，該研究組又利用AuNPs與琉基化的磷酸根的專一作用將其組裝到電極表面，用于蛋白磷酸化的分析。以上方法簡單、直接、易實現，但因為只是利用金納米粒子本身的電學特性實現蛋白激酶的檢測，使得檢測的靈敏度不夠高。本研究組設計了一種新型高靈敏電化學發光（ECL）生物傳感器，利用AuNPs作為信號傳導探針催化魯米諾電化學發光反應，顯著增強魯米諾的ECL信號，實現了蛋白激酶的高靈敏檢測，同時該方法還有效避免了ECL反應中強氧化劑的使用，具有很好的穩定性。
AuNPs大的比表面積，良好的生物相容性，易與琉基或其他生物配體結合的性質使其成為很好的載體，信號分子或其它活性物質在其表面可實現信號的放大。利用功能化的AuNPs作為信號分子的載體，在其上，錯離子同時與磷酸化的多膚連接�；陟o電作用，該載體可吸附大量帶正電荷的，故可通過檢測 （NH3）電量的變化實現蛋白磷酸激酶的高靈敏檢測回。在上述研究基礎上。將負載信號分子的過程簡化，直接將功能化的AuNP、通過共價鍵合的方法負載半肌氨酸修飾，構建了一種新穎的電化學發光生物傳感器用于蛋白磷酸化的高靈敏檢測。以上方法很大程度提高了檢測的靈敏度，但因為可溶性的電活性物質的引入，使得背景信號也升高。Wang等為了避免運用可溶性的電活性物質產生的較高背景，減小信噪比，將AuNP、負載大量的辣根過氧化酶（HRP）及親和素，利用生物專一性作用將辣根過氧化酶固定在電極上。HRP可催化聯苯胺的氧化，產生電化學信號，經AuNPs放大后電化學信號可用于磷酸化作用的檢測。與之前的報道相比，該傳感器的檢出限低兩個數量級。目前，本研究組仍致力于功能化的AuNPs信號放大體系用于蛋白激酶的活性檢測及其抑制劑的研究：第一個體系主要是利用AuNPs—DNA中DNA的雜交技術形成網狀大結構作為載體，負載豐富的電活性物質，以實現電信號的顯著增強；第二個體系是構建一個雙信號放大的生物傳感器，結合電化學發光技術高的靈敏性，一方面利用AuNPs催化放大魯米諾的電化學發光信號，另一方面通過AuNPs表面負載的多酶催化葡萄糖產生雙氧水，間接催化放大ECL信號，實現高靈敏檢測的目的。
AgNPs的信號放大作用在靈敏檢測磷酸化的膚段中也有相關應用。利用T102納米粒子既可充當磷酸基團特異性鍵合的鍵合劑，又可充當感光劑的優勢，在紫外照射下，使得Ag+光催化還原為AgNPs沉積在Ti02納米粒子的表面以實現信號增強，從而構建一種靈敏檢測蛋白激酶活性的生物傳感器。Li等用AuNPs作信標，利用共振光散射法對實際樣品不同細胞裂解液中蛋白激酶的活性進行檢測，并對不同細胞的酶的活性表達水平進行了比較。因為AuNPs的共振光散射強度較弱，因此引入沉積的AgNPs可以增強檢測的信號強度，提高檢測靈敏度。
3。 2基于量子點
量子點是具有納米尺寸的半導體晶體，因具有獨特的光學、電學和電化學性質，目前己成為生物識別和生物傳感過程中一類理想材料�；赒Ds的發射波長可隨其尺寸和形態自由調整的特點，可將其作為熒光探針應用于DNA檢測、免疫分析、蛋白質分析尤其是蛋白激酶活性分析。
設計了一種基于量子點一蛋白質的生物扼合物，利用熒光共振能量轉移的方法檢測蛋白激酶活性。其中，受體修飾在抗磷酸化膚的抗體上，量子點作為熒光能量轉移的供體，當膚段發生磷酸化后，受體和供體便可近距離接觸，發生能量共振轉移，以增強受體熒光強度。在一定范圍內，磷酸化的程度越高，在670 nm的熒光強度就越高。以上方法是利用量子點可作電子或能量的供體來實現蛋白激酶活性的靈敏檢測。但這些方法都需要將多膚束縛在量子點的表面以使得供體和受體盡可能靠近，以達到能量或電子轉移的目的，方法存在較大的局限性。
在電化學檢測方法上，基于QDs的信號放大在蛋白磷酸化分析中的應用報道較少。Pin—wattan。等Cool設計了一種基于CdSe/ZnS QD、的電化學免疫傳感器，用于磷酸化的牛血清蛋白的分析檢測。在該夾心型免疫傳感中，QDs既用于電化學信號放大，又用于連接抗磷酸化絡氨酸抗體。另外，由于多種類型QDs具有電致發光的特性，表面可通過配位或聚合物修飾等方式連接有機分子或生物大分子，基于QDs的電化學發光生物傳感器有望成功應用到蛋白磷酸化的分析中。但QDs屬于半導體材料，其導電性略差。
3。 3其它納米材料除了AuNPs和QDs之外，其它類型納米粒子在蛋白磷酸化分析中也有應用。碳納米材料因其良好的導電性和大的比表面積可作為納米載體負載多酶、信標等，也可很好地實現蛋白磷酸化分析的信號放大。Du等利用石墨烯氧化物（GO）作為納米載體負載大量的HRP和二抗，設計了一種新型的電化學免疫傳感用于磷酸化蛋白的超靈敏檢測。隨后，研制出一種基于石墨烯的電化學免疫傳感器。石墨烯作為傳感平臺不僅加快了電子傳遞而且增加了表面積以捕獲更多，導致檢測靈敏度顯著增強。另外，Chen等基于Zr4+與磷酸根的強配位作用作為信號轉換器，利用磷酸根修飾的介孔硅包埋作為信號放大器，構建了一種靈敏、簡單、無標記的電化學發光傳感器，用于蛋白激酶的活性分析。
4結論與展望
蛋白磷酸化分析經過幾十年的發展，在靈敏檢測、選擇性富集方面取得了很大的進展。本綜述在納米材料的富集方面主要涉及介孔納米材料、磁性納米材料和碳納米材料，分析了這些材料在磷酸化多膚或蛋白富集方面的優缺點以及改進之處。在基于納米材料的信號放大方面，主要涉及金屬納米粒子和量子點以及碳材料等。優點是結合納米材料和信號放大技術可很好地實現蛋白激酶的快速、高靈敏和選擇性檢測。缺點是過程操作相對復雜、需多步組裝、在磷酸化的多膚和信號放大部分經常需要加入額外的鏈接劑（如抗原抗體、生物素親和素以及親和性的金屬離子或氧化物）。
在未來的研究中可能主要圍繞以下方面開展：
�、俪顺Ｒ姷碾娀瘜W方法、質譜法、熒光法外，還可以嘗試運用新的方法檢測蛋白激酶活性（如光電化學法）。因為量子點均具有發光特性，在合適的激發光的刺激下發生躍遷可產生電流Coal，在磷酸化分析方面存在潛在的應用。
�、谀壳�，雖然對于蛋白磷酸化的研究層出不窮，但實際應用卻比較少，因此，致力于實際樣品的檢測應是今后的努力方向。
�、蹖ふ倚碌牟牧�。尤其是具有選擇性識別或捕獲磷酸化膚或蛋白的納米材料，以簡化蛋白磷酸化分析的過程。例如，目前最新發展起來的MOFs材料在磷酸化分析方面很有應用價值，因為其本身的金屬離子可識別磷酸化的多膚，而孔洞結構、大的比表面積以及易于修飾的能力使得該材料可以作為信號放大的良好載體或是作為富集器，在復雜生物體中選擇性富集磷酸化多膚。
【納米材料在蛋白磷酸化分析中的應用論文】相關文章：
納米材料修飾電極在電分析中的應用03-16
納米材料在化工行業中的應用分析03-18
納米材料論文10-21
淺談納米材料的應用03-20
室溫離子液體在無機納米材料制備中的應用03-22
納米材料初探論文12-01
淺論納米材料的特性及應用03-01
納米材料在電池中的應用02-21
微乳化技術在納米材料制備中的應用研究03-20
納米材料在化工生產中的應用03-14