淺談化學消毒的中和劑對水中內毒素活性檢測的影響論文
細菌內毒素又稱脂多糖，是革蘭氏陰性細菌和某些藍藻的細胞壁組分物質，活菌釋放較少，主要由菌體解體后釋放. 內毒素是常見的外源性致熱原，屬于強免疫刺激因子，具有廣泛的生物活性，與多種人類疾病密切相關. 機體對內毒素反應極為敏感，Elin 等報道使用0. 1 ～ 0. 5 ng·kg - 1 內毒素進行體內注射可以引起人體的發熱反應. 血液暴露是內毒素的主要暴露途徑. 為了保證與血液接觸的藥品、醫療器械及醫療用水的安全性，內毒素檢查一直被認為是醫藥行業的重要檢驗項目. 目前內毒素的法定檢測方法是鱟試驗，其機制是鱟血中阿米巴細胞與內毒素發生一系列酶促反應導致凝集反應. 光度法鱟試驗( 濁度法和顯色法) 是內毒素的定量測試方法，2005 年中國藥典正式將光度法收錄. 鱟試驗屬于生物毒性測試，不是精確的分析方法，干擾因素很多. 藥典規定鱟試驗中常用的干擾去除方法是對樣品多倍稀釋，并控制加標回收率在50% ～ 200%之內. 但是，對于嚴重干擾的樣品經多倍稀釋后內毒素活性降低，有時不能達到測試劑的最低檢測限，難以保證合適的回收率. 因此，在鱟試驗前不僅需要確定樣品含有的干擾因素，還需要避免添加嚴重干擾鱟試驗的物質. 另外，在采用光度法鱟試驗時，還應避免添加影響光密度值的物質.
近年來細菌內毒素的研究領域從醫藥行業逐漸外展，水體環境內毒素所致潛在的健康風險已經引起越來越多關注. 當水中微生物增殖或者藍藻暴發，菌體死亡或者經過消毒處理后釋放的大量內毒素，可以通過呼吸和胃腸暴露等途徑危害機體健康.在水消毒工藝方面，不同的消毒工藝、消毒劑量和反應時間都會對內毒素的釋放和控制效果帶來影響. 在評價化學消毒措施對內毒素釋放的控制效果時，必須先采用中和劑來去除樣品中殘留消毒劑，因此應該避免化學消毒的中和劑對鱟試驗結果的干擾. 目前環境領域和醫療領域常見化學消毒的中和劑有多種，如組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、吐溫80、亞硫酸鈉和硫代硫酸鈉等. 這些中和劑對所試微生物無抑制或殺滅作用，對培養基的營養成分無破壞作用，但是對鱟試驗檢測結果的干擾情況尚不清晰.本研究采用動態濁度鱟試驗，探討常見的中和劑單獨使用時對內毒素活性定量檢測結果的干擾情況，旨在選擇適用于內毒素檢測的中和劑，并確定合適的使用濃度范圍.
1 材料與方法
1. 1 玻璃器皿
無熱原稀釋試管( 15 mm × 100 mm) 、無熱原反應試管( 8 mm × 75 mm) 和無熱原移液器吸頭購買自湛江安度斯生物公司. 其他玻璃器皿經鉻酸浸泡24 h，熱自來水沖洗，超純水沖洗，馬弗爐干烘350 ～400℃ 2 h 去除熱原.
1. 2 儀器與試劑
內毒素定量檢測采用ATI320-06 動態試管儀及配套軟件( Lab Kinetic 公司，英國) . pH 值測定采用Pb-21 酸度計( Sartorius 公司，德國) . Mill-Q 純水機( Millipore 公司，美國) . 另外，還需要渦旋混合器、馬弗爐、移液器. 動態濁度法鱟試劑( 最低檢測限0. 03 EU·mL - 1 ) 、無熱原檢查用水( < 0. 003EU·mL - 1 ) 和無熱原Tris-HCl( pH 7. 4) 緩沖溶液購買自湛江安度斯生物公司. 內毒素工作標準品( control standard endotoxin，CSE，批號150601，每支90 EU) 購買自中國藥品生物制品檢定所( 北京) .生物化學試劑如抗壞血酸、Na2SO3和Na2S2O3為分析純，組氨酸、甘氨酸和吐溫80 購買自Sigma公司.
1. 3 動態濁度法鱟試驗檢測內毒素活性
采用動態濁度鱟試驗定量檢測內毒素活性，將0. 1 mL 鱟試劑加入反應管，加入0. 1 mL 樣品混合均勻，立即放入ATI320-06 動態試管儀進行檢測.樣品和鱟試劑在37℃ 溫育條件下發生凝集反應，ATI320-06 動態試管儀及軟件生成每個樣品的反應動態曲線，記錄反應試管在波長405 nm 處達到95%透光率的達限時間. 樣品的達限時間和所含內毒素活性負相關，根據標準曲線來確定樣品內毒素活性. 每個樣品采用2 個平行樣，并以0. 1EU·mL - 1CSE 溶液作為陽性對照，記錄回收率、稀釋倍數、達限時間等其他參數. 樣品測試3 次取均值. 試驗結果應滿足以下條件: ① 標準曲線中陰性對照的達限時間長于最低活性( 0. 031 25EU·mL - 1 ) 的達限時間. ② 標準曲線相關系數R 大于0. 98. ③ 平行樣的變異系數不得大于10%. ④根據藥典規定，加標回收率在50% ～ 200% 之間認為稀釋倍數合適，沒有明顯的干擾.
1. 4 內毒素檢測的'干擾試驗
( 1) CSE 溶液的配制打開CSE( 每支90EU) ，向安瓿瓶內加1 mL 無熱原檢查用水配制成90EU·mL - 1的CSE 溶液，密封后采用渦旋混合15min. 將CSE 溶液轉移至無熱原玻璃容器，加無熱原檢查用水稀釋成0 ～ 2 EU·mL - 1的CSE 溶液.
( 2) 0 ～ 1. 0%濃度的中和劑對鱟試驗的影響
采用無熱原檢查用水，將組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、吐溫80、亞硫酸鈉( 堿性) 和硫代硫酸鈉配制成濃度0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、5. 0%和10. 0%的中和劑溶液. 此外，采用無熱原Tris-HCl( pH 7. 4) 緩沖溶液配制濃度分別為0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、5. 0%和10. 0%的亞硫酸鈉( 中性) 溶液. 將已配制的不同濃度中和劑溶液按1∶ 9的比例添加至0 ～ 2EU·mL - 1的CSE 溶液中，檢測組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、吐溫80、亞硫酸鈉( 堿性) 、亞硫酸鈉( 中性) 和硫代硫酸鈉濃度分別在0、0. 05%、0. 1%、0. 2%、0. 5%和1. 0%情況下內毒素活性的變化.
( 3) 0 ～ 5. 0%濃度的硫代硫酸鈉對鱟試驗的影
響將硫代硫酸鈉加無熱原檢查用水溶解，配制成0、2. 5%、5. 0%、10. 0%、15. 0%、20. 0% 和25. 0%的硫代硫酸鈉溶液. 將已配制的硫代硫酸鈉溶液按1∶ 4的比例添加至0 ～ 2 EU·mL - 1 的CSE 溶液中，檢測硫代硫酸鈉濃度分別在0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%和5. 0%情況下內毒素活性的變化.
2 結果與分析
2. 1 常用的有機類中和劑對鱟試驗結果的影響
組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸和吐溫80 是常用的有機類中和劑，在0 ～ 1. 0% 的濃度范圍對動態濁度法鱟試驗的干擾結果. 結果表明，甘氨酸對內毒素活性的檢測未見明顯干擾，組氨酸、抗壞血酸和吐溫80 對檢測結果均有不同程度的影響，干擾程度詳. 其中，0～ 1. 0%濃度的組氨酸對內毒素活性的定量檢測引起強烈的增強效果; 抗壞血酸引起顯著的抑制效果; 吐溫80 引起明顯的抑制作用. 甘氨酸和組氨酸等氨基酸類用來中和醛類消毒劑. 由于組氨酸是類內毒素物質，可以引起內毒素的聚集和吸附，嚴重影響光度法鱟試驗的光度值，導致檢測結果的增強. 當組氨酸濃度從0 提高至0. 05% 時，檢測結果從初始內毒素活性0. 38EU·mL - 1 增高至0. 95 EU·mL - 1，增強率達到150%; 當組氨酸濃度從0. 05% 提高至0. 5% 時，內毒素活性提高至3. 30 EU·mL - 1，增強率達到768%. 0 ～ 1. 0% 濃度的甘氨酸對鱟試驗結果基本無明顯干擾. 檢測結果表明當甘氨酸濃度從0 提高至1. 0%時，初始內毒素活性1. 22 EU·mL - 1 增高至1. 39 EU·mL - 1，增強率僅為14%. 但是，甘氨酸和戊二醛的中和產物顯黃色，會對光度法鱟試驗( 濁度法和顯色法) 產生嚴重干擾，因此在光度法鱟試驗中，甘氨酸不適于做戊二醛的中和劑使用. 吐溫80 是常用的中和劑，可以和卵磷脂配伍用于清除吸附力較強的離子型消毒劑如季銨鹽類和酚類. 0～ 1. 0%濃度的吐溫80 對內毒素檢測引起明顯的抑制效果. 當吐溫80 濃度從0 提高至1. 0% 時，檢測結果從初始內毒素活性1. 18 EU·mL - 1 降低至0. 69EU·mL - 1，抑制率為41%. 抗壞血酸是常用的抗氧化劑，可以用作鹵素消毒的中和劑. 0 ～ 1. 0% 濃度的抗壞血酸對鱟試驗結果引起顯著的抑制效果. 當抗壞血酸濃度從0% 提高至0. 05%，檢測結果從初始內毒素活性1. 23 EU·mL - 1 降低至0. 70EU·mL - 1，抑制率達到43%; 當抗壞血酸濃度提高至1. 0% 時，內毒素活性降低至0. 34 EU·mL - 1，抑制率達到72%. 抗壞血酸的酸性強，向樣品中添加會導致內毒素的酸解或者對鱟試劑酶活性造成破壞，抑制鱟試驗的反應并影響檢測結果.
2. 2 常用無機類中和劑對鱟試驗結果的影響
亞硫酸鈉和硫代硫酸鈉是常用的無機類中和劑，其在0 ～ 1. 0%的濃度范圍對動態濁度法. 亞硫酸鈉是鹵素和醛類消毒劑的中和劑，由于亞硫酸鈉的堿性強，使用時分為堿性和中性兩種情況. 0 ～ 1. 0%濃度的亞硫酸鈉( 堿性) 對內毒素檢測有明顯的增強效果. 當亞硫酸鈉( 堿性) 濃度從0 提高至1. 0%時，檢測結果從初始內毒素活性1. 08 EU·mL - 1增高至1. 50 EU·mL - 1，增強率為39%. 亞硫酸鈉( 堿性)對鱟試驗有增強效果，這是因為鱟試劑中含有一定數量的Ca2 + 和Mg2 + 用來保持試劑的分散性，OH- 的增多會影響Ca2 + 和Mg2 + 的狀態，導致鱟試劑分散性差，引起反應產物聚集導致增強結果. 0 ～ 1. 0% 濃度的亞硫酸鈉( 中性) 對內毒素檢測引起顯著的抑制作用. 亞硫酸鈉( 中性) 濃度從0 提高至1. 0%時，檢測結果從初始內毒素活性1. 08 EU·mL - 1 降低至0. 38EU·mL - 1，抑制率為65%. 雖然亞硫酸鈉在調節pH值至中性后，可以消除水樣的堿度帶來的干擾，但是添加的H+ 和SO2 -3生成的HSO-3破壞鱟試劑中酶的活性，對鱟試驗有抑制效果. 硫代硫酸鈉是鹵素類消毒劑、汞制劑及過氧乙酸等的中和劑. 0 ～1. 0%濃度的硫代硫酸鈉對鱟試驗結果基本無明顯干擾，當硫代硫酸鈉濃度從0 提高至1. 0%時，內毒素活性從初始值1. 08 EU·mL - 1降低為1. 01 EU·mL - 1，抑制率僅為6. 5%. 但是當硫代硫酸鈉濃度提高至1. 0% ～5. 0%時，對內毒素檢測結果有明顯的抑制效果. 因此，低濃度的硫代硫酸鈉溶液適于在鱟試驗之前作為消毒劑的中和劑，但是濃度應該控制在0. 5%以內.
3 結論
( 1) 在0 ～ 1. 0% 濃度范圍內，除甘氨酸和硫代硫酸鈉之外，組氨酸、抗壞血酸、吐溫80 和亞硫酸鈉( 中性和堿性) 對內毒素檢測結果均有不同程度的干擾.
( 2) 組氨酸對內毒素活性的定量檢測有強烈的增強效果; 抗壞血酸引起顯著的抑制效果; 吐溫80引起明顯的抑制效果; 亞硫酸鈉( 堿性) 引起明顯的增強效果; 亞硫酸鈉( 中性) 有顯著的抑制效果.
( 3) 此外，0 ～ 1. 0% 濃度的甘氨酸對內毒素檢測基本無明顯干擾，但是甘氨酸和戊二醛的中和產物呈黃色，當作為戊二醛的中和劑使用時會對光度法鱟試驗的結果產生干擾. 0 ～ 1. 0%濃度的硫代硫酸鈉對鱟試驗結果基本無明顯干擾，但是高濃度的硫代硫酸鈉( 1. 0% ～ 5. 0%) 會對鱟試驗引起明顯的抑制效果.
( 4) 與組氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、吐溫80 和亞硫酸鈉相比，硫代硫酸鈉更適合在鱟試驗之前用作中和劑，但是濃度應控制在0. 5% 范圍以內. 此外，有些消毒措施不適合選擇硫代硫酸鈉作為中和劑，需進一步篩選出對鱟試驗無明顯干擾的其他中和劑，避免使用組氨酸、抗壞血酸、吐溫80 和亞硫酸鈉這類對鱟試驗有干擾的中和劑.
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