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三七總苷對佐劑性關節炎大鼠腹腔巨噬細胞釋放一氧化氮的影響探析
【摘要】
�。勰康模菅芯�37總苷（PNS）對佐劑性關節炎（AA）大鼠腹腔巨噬細胞釋放1氧化氮（NO）的影響。［方法］大鼠右后足跖皮內注射弗氏完全佐劑誘發大鼠AA模型，采用硝酸還原酶法檢測AA大鼠腹腔巨噬細胞釋放的NO。［結果］體外給藥PNS 0.4mg/ml，作用4h時，增加AA大鼠NO釋放（P<0.05）；體外給藥PNS 0.2mg/ml 及0.4mg/ml，作用8h時，抑制AA大鼠NO釋放 （P<0.05，P<0.01）；體外給藥PNS 0.8mg/ml及PNS 1.6mg/ml，作用24h時，增加AA大鼠NO釋放 （P<0.01，P<0.05）。［結論］PNS體外給藥隨濃度及作用的時間變化，對AA大鼠釋放NO有雙向調節作用，PNS抑制 AA大鼠腹腔巨噬細胞釋放NO可能在AA治療中起1定的作用。
【關鍵詞】 37總苷 佐劑性關節炎 1氧化氮
Abstract(冒號)：［Objective］To investigate the influence of panax notoginseng saponins （PNS）on production of Nitric Oxide（NO） by peritoneal macrophages of rats with adjuvant arthritis（AA）.［Methods］Complete Freunds adjuvant was used to induce AA in rats.Production of NO by peritoneal macrophages of rats with adjuvant arthritis was determined by nitrate reductase.［Results］PNS 0.4mg/ml increased NO synthesis and secretion from peritoneal macrophages of AA rats in vitro after four hours（P<0.05）；PNS 0.2mg/ml and 0.4mg/ml reduced NO synthesis and secretion from AA rats in vitro after eight hours respectively（P<0.05，P<0.01）；PNS 0.8mg/ml and 1.6mg/ml increased NO synthesis and secretion from AA rats in vitro after twenty?four hours respectively（P<0.01，P<0.05）.［Conclusion］ PNS has bidirection influence on production of NO by peritoneal macrophages of AA rats with change of concentration and times.PNS reduced NO synthesis and secretion from peritoneal macrophages of AA rats，which may be effective on treating AA.
Key words(冒號)：panax notoginseng saponins；adjuvant arthritis；Nitric Oxide
37Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen為5加科人參屬植物的根，具滋補強壯、止血、活血化瘀、消腫止痛的功效。37總苷（panax notoginseng saponins，PNS）是37的主要活性成分，研究顯示，PNS有較強的抗炎鎮痛作用［1?2］。在臨床實踐中，我們應用PNS治療類風濕關節炎，在短期內控制RA病情急性活動，減輕軟組織腫脹，改善關節功能等療效。為進1步探討PNS抗炎作用的可能機制，本文進行了PNS對佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠腹腔巨噬細胞釋放NO影響的研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 模型制作及給藥方法 動物實驗性喂養2周后，參照文獻［3］以卡介苗與弗氏不完全佐劑充分乳化混勻配成10mg／ml的乳劑，于每鼠右后足跖皮內注射0.05ml致炎。2周后分離腹腔巨噬細胞。
1.2.2 DMEM培養液配制
1.2.3 腹腔巨噬細胞的分離純化及培養 大鼠頸動脈放血，腹腔注入預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）（PH7.2）10ml灌洗腹腔，輕揉腹部后取腹腔液。1200r/min離心10min，吸棄上清，用DMEM培養液混懸沉淀，調至5×108/L，加入24孔培養板中，每孔1ml，置入37℃、5%CO2培養箱內差速貼壁1h。吸棄培養液，用DMEM培養液洗3次，以除去非粘附細胞，獲單層腹腔巨噬細胞。每孔加入含10%小牛血清DMEM培養液及LPS（終濃度為10μg/ml），并按如下6個實驗組給予不同的處理，每組4孔，地塞sai米松（DM）作為陽性對照組。6個實驗組依次是(冒號)：AA組、AA+PNS 0.2mg/ml組、AA+PNS 0.4mg/ml組、AA+PNS 0.8mg/ml組、AA+PNS 1.6mg/ml組、AA+DM 10?7mmol/L組。置37℃、5%CO2培養箱中分別培養1、4、8、24h，每次取0.2 ml上清液，-20℃保存待測。
1.2.4 1氧化氮檢測 NO化學性質活潑，在離體標本液中主要氧化成亞硝酸鹽，因此，測定標本中亞硝酸鹽的濃度可作為衡量NO水平的指標。本試驗取凍存培養液上清100μl，室溫溶解后，依1氧化氮試劑盒說明書操作，以硝酸還原酶法測定標本液中的亞硝酸鹽濃度，550nm，0.5cm光徑，測吸光度值。NO含量（μmol/L）＝（測定管吸光度-空白管吸光度）/（標準管吸光度-空白管吸光度）×標準品濃度（100μmol/L）。
1.2.5 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件進行數據處理，測定值以均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有顯著性統計學意義。
2 結果
各組腹腔巨噬細胞釋放NO量隨時間變化的情況見表1。腹腔巨噬細胞培養1h時，各組間釋放NO量的差異無統計學意義（P>0.05）；培養4h時，AA+PNS 0.4mg/ml組及AA+DM 10?7mmol/L組與AA組相比NO釋放量升高，差異有顯著性意義（P<0.05）；培養8h時，AA +PNS 0.2mg/ml組與AA組相比NO釋放量降低，差異有顯著性意義（P<0.05）；同時AA+PNS 0.4mg/ml組與AA組相比NO釋放量也降低，差異有非常顯著性意義（P<0.01）；培養24 h，AA+PNS 0.8mg/ml組及AA+DM 10?7mmol/L與AA組相比NO釋放量升高，差異有非常顯著性意義（P<0.01）；AA+PNS 1.6mg/ml與AA組的差異有顯著性意義（P<0.05）。
表1 （略）
與AA組比較，*P<0.05，** P<0.01
3 討論
NO對免疫系統有雙重作用，既是免疫系統發揮作用所不可缺少的參與分子，又可由于過量產生而導致組織損傷。NO可促進巨噬細胞釋放許多炎癥介質，如腫瘤壞死因子（TNF?α） 和白介素1 （IL?1）等，在免疫性炎癥病理中起重要作用［4］。大鼠佐劑性關節炎（AA）是用于RA發病機制研究及抗炎藥物篩選的1種常規模型，研究表明由誘生型1氧化氮合酶iNOS誘導產生大量的NO，在大鼠AA發病機制中起重要作用［5］，AA大鼠的多發性關節病變與NO的過量產生有關［6］，對NO產生的抑制必然可使組織損傷得到1定程度的緩解，起到治療作用［7］。
以往有學者研究PNS對降低燒傷小鼠腹腔巨噬細胞產生NO有顯著的作用［8］。本研究結果顯示，PNS 對AA大鼠腹腔巨噬細胞釋放NO的調節作用與藥物作用的時間及劑量有1定關系，在較小的濃度較短的時間（PNS0.4mg/ml，培養4h）以及較大的濃度較長的時間（PNS0.8mg/ml及PNS1.6mg/ml，培養24h）對NO的釋放均有促進作用，而在1定的濃度和時間（PNS0.2mg/ml及PNS0.4mg/ml，培養8h）對NO的釋放有1定的抑制作用。
由此可見，PNS體外給藥對AA大鼠釋放NO有雙向調節作用，推測PNS對AA大鼠腹腔巨噬細胞釋放NO的抑制作用可能在佐劑性關節治療中起1定的作用。其雙向調節作用的機制有待于進1步的研究證實。
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