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氧化鋁柱層析精制三七總皂苷工藝研究
【摘要】 目的 研究氧化鋁柱層析精制三七總皂苷工藝。方法 采用HPLC法測定三七總皂苷的含量，考察洗脫劑的濃度、洗脫劑的用量和吸附劑用量對工藝的影響。結果 確定最佳精制工藝為：洗脫劑的濃度為55%乙醇，洗脫劑的用量為10倍吸附劑的用量，吸附劑用量為5倍三七總皂苷的用量。結論 通過氧化鋁柱層析精制后，三七總皂苷的收率大于70%，含量大于80%，說明此精制工藝是可行的。
【關鍵詞】 三七總皂苷 氧化鋁 高效液相法
三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根及根莖[1]，三七總皂苷是中藥三七的有效部位，主要含有三七皂苷R1，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1等達瑪烷型三萜皂苷類化合物[2]。現代藥理研究證明：三七總皂苷具有多方面的生物活性，主要表現在擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、改善心肌代謝、抗自由基、抗凝、鈣拮抗等方面[3]。
目前三七總皂苷的富集與純化一般采用大孔吸附樹脂來完成[4]，純化后三七總皂苷的含量達到60%以上。為了提高藥物的安全性和有效性，提高其成藥原料藥的純度。本實驗擬采用氧化鋁柱層析對三七總皂苷的純化物進行精制[5]，并對工藝進行了考察，為進一步的制劑學研究打下基礎。
1 儀器與試藥
1.1儀器與設備
RE 52-99旋轉蒸器（上海亞榮生化儀器廠）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；JA-1003型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限醫療設備廠）；美國Tsp高效液相色譜儀；Tsp P-2000泵、TspUV-1000UV-VIS檢測器；TspPC1000色譜工作站；色譜柱：ODSC18柱（250×4.6mm,5μm,大連依利特科學儀器有限公司）。
1.2材料與試劑
三七總皂苷提取物（云南玉溪天然藥物有限公司）；三七總皂苷對照品：三七皂苷R1（0745-200008）、人參皂苷Rg1（0703-200015）、人參皂苷Rb1（0704-200115）對照品（中國藥品生物制品檢定所）；乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水。
2 方法與結果
2.1色譜條件
色譜柱：ODSC18柱（250×4.6mm,5μm）；流動相：A為乙腈，B為水；流速：1.0mL·min-1；采用梯度洗脫法，0～8分鐘（26:74），8:10～40:40分鐘（34:66）；檢測波長203nm；柱溫：30℃；進樣量20μL。
2.2線性范圍關系的考察
分別精密稱取三七總皂苷對照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1各約6.0mg、2.5mg和2.5mg置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取此溶液3、4、5、6、7mL置50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述對照品溶液各注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，以峰面積(A)對進樣量(μg)進行線性回歸，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1回歸方程分別為：A=327127.8W－681.2（r=0.9991）；A=406964.1W+787.9（r=0.9991）；A=262563.9W－5498.7（r=0.9996），三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂Rb1分別在進樣量0.2981～0.6956μg、1.2768～2.9792μg和1.1539～2.6925μg范圍內時，峰面積與進樣量具有良好的線性關系。
2.3精密度試驗
取含量測定項下對照品溶液，連續進樣六次，記錄色譜圖，量取峰面積，計算平均值及相對標準偏差，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的峰面積平均值分別為151792、802039.7和476940.7，RSD分別為0.81%、1.73%和1.62%，結果表明，本方法精密度良好。
2.4供試品溶液的制備
取上柱流出液濃縮至干，精密稱定干粉一定量，用甲醇溶解并轉溶至10mL量瓶，濾過。精密量取續濾液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.5工藝參數的考察
2.5.1洗脫劑濃度的考察
取三七總皂苷原料3份，每份10g。分別用50%乙醇適量溶解，分別轉移至氧化鋁柱（中性氧化鋁50g，內徑4cm，干法裝柱），然后分別用35%、55%和75%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥，按HPLC法測定總皂苷含量和收率。
從以上結果可知，當用75%乙醇洗脫時，總皂苷含量最高，但收率太低，而用55%乙醇洗脫時雖然收率比用35%乙醇洗脫時略低，但總皂苷含量高6%左右，因此，洗脫劑確定為55%乙醇。
2.5.2洗脫劑用量考察
取三七總皂苷原料3份，每份10g。分別用50%乙醇適量溶解，分別轉移至氧化鋁柱（中性氧化鋁50g，內徑4cm，干法裝柱），然后用55%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥，按HPLC法測定總苷含量和收率。
從以上結果可知，隨著洗脫劑用量的增加，得到總皂苷的含量逐漸下降，考慮收率，以10倍量55%的乙醇洗脫比較合適。
2.5.3吸附劑用量考察
取三七總皂苷原料3份，每份10g。分別用50%乙醇適量溶解，分別轉移至氧化鋁柱（柱1：中性氧化鋁25g，內徑2cm；柱2：中性氧化鋁50g，內徑4cm；柱3：中性氧化鋁100g，內徑5cm），然后用10倍量55%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥，按HPLC法測定總苷含量和收率。
從以上結果可知，隨著吸附劑氧化鋁用量的增加，收率逐漸降低，而含量呈上升趨勢，氧化鋁用量為5倍與10倍相比較，前者雖然總皂苷含量略低，但已經大于80%，而且收率較高，因此吸附劑氧化鋁的用量確定為5倍。
2.6中試驗證結果
取三七總皂苷原料3份，精密稱取質量分別為44.4g，42.8g和47.9g，分別用50%乙醇適量溶解，分別轉移至氧化鋁柱，中性氧化鋁用量為三七總皂苷的5倍，然后用10倍量55%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，在60℃以下減壓回收乙醇，真空干燥，按HPLC測定方法，分別測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量。
從以上三批中試結果可知，按選定的精制工藝可以制備總皂苷含量大于80%的三七總皂苷原料，且收率大于70%，說明此精制工藝是可行的。
3 結論
3.1氧化鋁柱層析精制三七總皂苷的最佳工藝為：洗脫劑的濃度為55%乙醇，洗脫劑的用量為10倍量吸附劑的用量，吸附劑用量為5倍三七總皂苷的用量。
3.2本實驗提出了一種新的三七總皂苷的精制方法—氧化鋁柱層析，具有分離效果好、工藝簡單、投資少、處理量較大等優點。有文獻報道[6]，大孔吸附樹脂法具有選擇性好、吸附容量大、安全無毒、再生容易等優點，但由于應用時間相對較短，還存在著一些問題，因此，在純化中藥有效成分的工藝過程中，兩種純化方法可以互相結合，取長補短，共同促進中藥制劑的不斷發展。
參 考 文 獻
[1]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典2005年版二部[S].北京：化學工業出版社， 2005: 9.
[2]甘煩遠.三七的化學成分研究概況[J]. 中國藥學雜志，1992，27(3): 128.
[3]Chan P, Tomlinson B. Antioxidant efects of Chinese traditional medicine: focus on trilinolein isolated from the Chinese herb sanchi(Panax pseudoginseng)[J]. J Clin Pharmacol, 2000, 40(5): 457.
[4]孫建平，崔淑霞，等.大孔吸附樹脂富集三七總皂苷的工藝研究[J].黑龍江醫藥，2007，3(20): 232-233.
[5]柳葉.氧化鋁柱層析分離純化磷脂的工藝優化[D].浙江大學碩士學位論文.杭州：浙江大學，2006.
[6]胡軍，周躍華，等.大孔吸附樹脂在中藥成分精制純化中的應用[J].中成藥，2002，24(2): 127-130.
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