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探討不同的胞外基質對ES細胞分化的影響
胚胎干細胞具有無限增殖和多向分化的特性，下面是小編搜集整理的一篇探究不同胞外基質對ES細胞分化影響的論文范文，供大家閱讀查看。
胚胎干細胞(embryonicstemcells,ES細胞)在體外可分化為3個胚層的所有細胞[1],定向誘導人ES細胞分化為造血干/祖細胞,可以為造血干細胞移植提供新的細胞來源.目前誘導人ES細胞向造血細胞分化多采用ES細胞與基質細胞共培養以及擬胚體的方法[2,3],但是這兩種方法分化效率均比較低,而且存在動物源性污染,離臨床應用距離甚遠.本研究采用人ES細胞在胞外基質上直接貼壁培養向造血細胞誘導,既沒有擬胚體復雜的三維立體結構,又不受基質細胞的影響,從而排除異源性污染,旨在建立人ES細胞分化為造血祖細胞的簡單高效的誘導體系,并探討不同的胞外基質對其分化的影響.
材料和方法
主要材料和試劑
人胚胎干細胞系PKU1.1由北京大學第三醫院生殖中心陳貴安教授饋贈,為PKU1連續傳代30代后建立的單細胞克隆亞系,染色體核型為46,XX[4].KnockOutTMDMEM培養液、KnockOutTM血清替代品(SR)和IMDM培養液以及胞外基質Fibronectin和CollagenIV均為美國Gibco/Invitrogen公司產品;Matrigel為美國BectonDickson公司產品;細胞因子均為美國PeproTech公司產品;HIT(人血清白蛋白+重組人胰島素+人轉鐵蛋白)和甲基纖維素培養液MethoCult4435+為加拿大StemCellTech-nology公司產品;流式抗體均為美國BectonDicksonPharmingen公司產品;MiniRNA提取試劑盒為德國Qiagen公司產品;SYBRGreenSuperMix為美國Bio-Rad公司產品;引物合成由北京奧科公司完成.
胞外基質預處理培養板
設立3組:分別將Matrigel、Fibronectin和CollagenIV置于4℃融化,以預冷的IMDM按1∶20比例稀釋.各取2ml均勻鋪于6孔培養板,37℃孵育2h,吸出后以IMDM清洗1遍,待用.
人ES細胞直接貼壁培養分步向造血干/祖細胞誘導第1步將生長5-6d后的人ES細胞經Dispase酶消化后,以基礎分化培養液(IMDM+HIT+MTG+谷氨酰胺+非必需氨基酸)重懸,按2×104細胞數/cm2的密度接種至胞外基質預先包被過的6孔培養板中貼壁培養,培養液中同時添加細胞因子骨形態發生蛋白(BMP4,25ng/ml)、血管內皮生長因子(VEGF,20ng/ml)和堿性成纖維生長因子(bFGF,10ng/ml)誘導7d;第2步更換細胞因子為干細胞因子(SCF,50ng/ml)、芙萊基3配體(Flt3L,50ng/ml)、白介素3(IL-3,10ng/ml)和白介素6(IL-6,10ng/ml)繼續誘導分化7d,共誘導14d.每3d更換新鮮的培養基和細胞因子.在倒置相差顯微鏡下觀察分化細胞的形態.將人ES細胞在未經胞外基質包被的培養板上培養且不添加細胞因子設為對照組.
造血集落形成試驗(CFU)
收集培養液中誘導14d的細胞,用PBS清洗2遍,用40μm無菌細胞篩過濾除去大的細胞團塊,將分化細胞按1×105細胞數/ml接種于半固體甲基纖維素培養基MethoCult4435+中培養,14d后在顯微鏡下觀察形成的細胞集落數目(CFC).
流式細胞術分析(FCM)
收集培養液中誘導14d的細胞,40μm無菌細胞篩過濾除去大的細胞團塊,將細胞密度調整為5×105細胞數/毫升,用PBS清洗3遍,分別加入小鼠抗人CD34-APC、小鼠抗人CD31-PE和小鼠抗人CD45-PE,同型對照為小鼠IgG1-APC和IgG1-PE,4℃避光孵育30min.碘化丙啶(PI)除去死細胞.上機分析分化細胞中各表面標志物陽性細胞的比例.
實時定量PCR檢測
分別提取人ES細胞以及誘導3、7和14d分化細胞的總RNA,反轉錄后采用SYBRGreen法進行實時定量PCR檢測造血特異性基因的表達.反應總體系為10μl,反應條件為95℃預變性5min;然后95℃變性10s,退火30s,共40個循環.各基因引物序列及退火溫度(Tm)見表1.采用2-ΔΔCt法進行數據處理.
統計學分析實驗數據以均數±標準差(珔X±SD)表示,應用SPSS17.0統計軟件分析,兩組之間進行t檢驗,3組以上進行單因素方差分析(ANOVA).P<0.05為差異有統計學意義.
結果
人ES細胞和分化細胞形態學觀察人ES細胞在無飼養層細胞的培養體系里呈巢狀集落樣生長,扁平狀,細胞之間界限清楚,細胞胞核大,胞質少,核質比高(圖1A).當人ES細胞在matrigel、纖維粘連蛋白和IV型膠原蛋白這3種胞外基質分別包被過的培養板里培養,添加造血生長因子開始誘導分化,3組分化細胞鏡下形態相似.
隨著誘導天數增加,人ES細胞邊界逐漸消失,分化出的細胞向四周擴散(圖1B),分化至10d細胞表面開始出現許多囊腔結構(圖1C),里面充滿著圓形細胞(圖1D),隨著誘導時間的延長,這些圓形細胞有的會從囊腔結構中跑出來,漂浮在液體里,直至誘導14d時分化細胞的表面布滿了圓形細胞(圖1E,F).在整個分化過程中,在對照組未出現囊腔結構以及圓形的細胞.
分化細胞的鑒定造血細胞集落形成培養2周后各實驗組顯微鏡下均可觀察到紅細胞系、粒細胞系和混合細胞集落等各系細胞集落(CFC)的形成(圖2B),3組細胞數分別為(10±1.5)×105、(16±3.5)×105及(51±6.1)×105,CollagenIV包被組形成CFC數目明顯多于Matrigal和Fibronectin組,具有統計學差異(P<0.01),其中形成CFU-E和CFU-G數目高于Matrigel以及Fibronectin組(P<0.05),形成CFU-GEMM數3組間未見顯著差異(P>0.05)(圖2A).對照組未見有造血集落的形成.
特異性標志物的表達流式細胞術分析誘導14d的分化細胞,結果顯示,Matrigel、Fibronectin以及CollagenIV組CD34陽性細胞數分別達到(7.18±0.32)%、(9.59±0.4)%、(14.42±0.69)%,CollagenIV組高于前2組(P<0.05);3個組中CD45陽性細胞數分別達到(0.04±0.005)%、(0.05±0.01)%、(1.49±0.08)%,CollagenIV組高于前2組(P<0.05);3個組中CD34和CD45雙陽性的細胞比例分別為(0.08±0.006)%、(1.16±0.12)%、(7.8±0.32)%,CollagenIV組顯著高于前2組(P<0.05);而3組中CD31陽性以及CD34和CD31雙陽的細胞數占有的比例無顯著的差異(圖3).在對照組細胞未檢測到CD34、CD31和CD45的陽性表達.
實時定量PCR分析造血細胞特異性基因的表達從圖4可以看出,隨著誘導分化啟動,ES細胞多能性標志物Oct4和Nanog在各組細胞中的表達迅速下降至消失(圖4A,4B),而中胚層標志物Brachyury、血液成血管細胞標志物Flk1以及造血系統特異性基因CD34和轉錄因子SCL在人ES細胞中(即分化第0d)幾乎不表達,分化第3d時Brachyury的表達量達到最高值,后逐漸下降直至消失,3組之間未見顯著差異(圖4C);3組Flk1的表達在分化第7d達高峰,3組Flk1相對表達量分別為25.74±3.65,27.83±2.41和63.03±7.99,且Matrigel和Fibronectin組顯著低于CollagenIV組(P<0.05),此后Flk1的表達開始下調(圖4D);隨著誘導天數的增加,CD34和SCL表達均呈上調趨勢,分化第14d時CollagenIV組的相對表達量分別為82.63±10.01和37.5±7.57,明顯高于Matrigel和Fibronectin組,差異具有顯著的統計學意義(P<0.01和P<0.05)(圖4E,4F).在對照組細胞未檢測到特定基因的表達.
討論
定向誘導分化是人ES細胞研究的重要內容,將人ES細胞誘導為造血細胞常采用傳統的基質細胞共培養和擬胚體誘導法,但是這些方法繁瑣,重復性查,獲得的細胞數量有限,而且分化體系中添加了成分不確定的胎牛血清,致使難以研究分化機制,也限制了其臨床應用.本實驗采用人ES細胞直接貼壁分化的誘導策略既沒有擬胚體復雜的三維結構,也不存在基質細胞或胎牛血清的動物源性污染,縮短與臨床應用的距離,同樣可以有效地產生造血祖細胞,這一方法成功的關鍵是胞外基質的選擇.研究表明,細胞微環境對維持人ES細胞自我更新以及細胞命運的決定極其重要,其中胞外基質是重要組成部分[5].胞外基質不但為細胞提供生長分化的支架,也提供維持細胞存活、遷移和命運決定的調控因子.胞外基質通常是大分子糖蛋白,包括基質膠(matrigel)、纖維黏連蛋白(fibrobectin)、膠原蛋白(collagen)、層黏連蛋白(laminnin)和蛋白多糖等.
本實驗采用人ES細胞接種至基質膠、纖維粘連蛋白和IV型膠原蛋白這3種胞外基質包被過的培養板上直接貼壁分化的誘導方法,產生的CD34+造血祖細胞最高達到15.06%,表達CD45的造血祖細胞可達7.8%,與傳統的基質細胞共培養和擬胚體法的分化效率相似,但是這一誘導方法簡單易操作,而且無血清、無基質細胞的培養體系更接近于未來的臨床應用.
造血過程中多種生長因子發揮著重要作用,外源性添加生長因子在一定程度上能模擬體內的造血微環境,促進造血發生.國外文獻報道,人ES細胞向造血細胞分化過程中需全程添加細胞因子,包括BMP4、bFGF、VEGF、SCF、Flt3L、IL-3和IL-6等[6,7].既往研究表明,人ES細胞向造血細胞分化過程中,只有BMP4能誘導產生對中胚層造血細胞發育必需的原條樣細胞群,啟動造血中胚層基因表達和少量造血祖細胞的產生;BMP4、VEGF、SCF和bFGF共同作用則誘導出高效的造血細胞[8].近年有研究證實,在人ES細胞向造血系分化過程中序貫加入不同的細胞因子更能有效地產生造血祖細胞[9].本研究整個分化過程中細胞因子分兩步添加,第1步加入BMP4、VEGF和bFGF,第2步加入SCF、Flt3L、IL-3和IL-6,誘導14d后對分化細胞進行鑒定,造血集落形成、流式細胞分析術以及實時定量PCR結果均證實人ES細胞有效地分化為造血祖細胞.本研究中外源性造血生長因子的添加誘導人ES細胞開始分化,實時定量PCR結果顯示所有實驗組分化細胞中干細胞多能性標志物Oct4和Nanog表達呈急劇下降的趨勢,盡管分化早期誘導效率很低,但是中胚層標志物Brachyury、血液成血管細胞標志物Flk1以及造血系統特異性轉錄因子SCL和基因CD34的相對表達量對于內參基因β-actin仍呈成倍增長,這是ES細胞一旦啟動分化,未分化狀態和多能性特性迅速喪失的結果[10].
本研究還比較了基質膠、纖維黏連蛋白和IV型膠原蛋白對產生造血細胞的不同作用.基質膠多用于人ES細胞無飼養層培養的培養皿處理[11],也可用于人ES細胞的貼壁誘導向造血細胞的分化[12].
纖維黏連蛋白和IV型膠原蛋白支持小鼠ES細胞來源的表達Flk1的祖細胞向造血細胞分化[13].纖維黏連蛋白能促進中胚層分化,誘導人ES細胞來源的內皮祖細胞向內皮細胞分化[14].IV型膠原蛋白也能促進中胚層發育,誘導人ES細胞向內皮、心血管和造血系的分化[15],但具體的分化效率并未報道.本研究中造血集落形成實驗顯示這3種胞外基質上培養誘導的細胞均具有造血干/組細胞的造血集落形成能力,而且IV型膠原蛋白上形成的造血CFC數目明顯高于其它兩組.流式細胞術分析顯示IV型膠原蛋白組CD34+和CD34+CD45+細胞數量顯著大于基質膠組和纖維黏連蛋白組;實時定量PCR結果顯示IV型膠原蛋白組造血特異性基因CD34和SCL的相對表達量最高.由此證實,采用人ES細胞直接貼壁的誘導方法選擇IV型膠原蛋白更利于向造血細胞分化.
本研究建立了一種人胚胎干細胞在胞外基質上直接貼壁培養、有效地分化為造血祖細胞的新誘導方法,為造血祖細胞的大量產生以及進一步分化產生其它功能性血細胞提供足夠的細胞來源,同時發現IV型膠原蛋白利于人胚胎干細胞向造血細胞誘導,為胚胎干細胞的定向誘導分化提供技術平臺.
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