Megalin基因片段3189-4169的克隆及其表達

Megalin基因片段（3189-4169）的克隆及其表達

【關鍵詞】 腎炎
　　【摘要】 目的 大鼠Heymann腎炎（HN）是人類膜性腎病的經典動物模型，其發病機制的研究推動了人們對膜性腎病的理解。Megalin是HN主要致病抗原，也是低密度脂蛋白受體家族成員，其胞外結構形成的4簇配體結合區域均可能存在抗原決定簇。本實驗擬克隆其第2簇配體結合區域，并表達融合蛋白，為進一步研究其抗原決定簇的確切位置及其功能打下基礎。方法 采用RT-PCR獲得大鼠腎目的片段Megalin基因3189-4169，再與原核表達質粒pTrcHis A結合構建重組質粒，然后將重組質粒轉入TOP10細菌誘導表達融合蛋白，最后用Western-Blot檢測表達的融合蛋白。結果 （1）RT-PCR獲得的目的片段大小為1kb，測序證實為Megalin基因3189-4169;測序報告還顯示有3個突變，分別位于Megalin基因的3404、3647、3702，其中前兩個突變都不影響融合蛋白的氨基酸序列，第3個突變則將賴氨酸變成谷氨酸，經分析對融合蛋白表達無明顯影響。（2）構建的重組質粒用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到預期的2個片段4.4kb和1kb，分別表示質粒pTrcHis A和Megalin基因3189-4169。（3）用IPTG誘導TOP10（含有重組質粒）融合蛋白表達后，經Western-Blot檢測發現了38kD的目的蛋白。陽性對照TOP/CAT在IPTG誘導前沒有出現蛋白條帶，在IPTG誘導后4h出現蛋白條帶；陰性對照TOP10（不含有質粒）和TOP10（含有pTrcHis A）經IPTG誘導后均無目的條帶出現。另外，融合蛋白的表達量在IPTG誘導后4~6h增加明顯。結論 成功構建了重組表達質粒（帶有Megalin基因3189-4169的pTrcHis A）；成功誘導了融合蛋白的表達，為進一步研究Megalin基因抗原決定簇的確切位置及研究Megalin的功能提供了基礎。

　　【關鍵詞】 腎炎;基因;表位;融合蛋白
　　【Abstract】 Objective Rat Heymann nephritis（HN）is a classic model of human membranous nephropathy.Research of its pathogenesis help understand the human membranous nephropathy.Megalin is the major antigen of HN,and it is also a member of the low density lipoprotein receptor gene family；its extracellular region can bind multiple ligands,and this extracellular region form four clusters of ligand-binding domains containing pathogenic epitopes.So we cloned the second cluster of ligand binding repeats and express the recombinant proteins containing N-Terminal 6xHis tags.This study was aimed to provide the basis to precisely locate the pathogenic epitope and help understand its function.Methods We applied reverse transcription PCR to obtain objective band（Megalin gene 3189-4169）,then constructed the recombinant plasmid by inserting this fragment into pTrcHis A.After the recombinant plasmid was transfected into TOP10,the expression of 6xHis fusion protein was induced by isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）.Finally Western-Blot was performed to detect the fusion protein.Results RT-PCR showed the size of object band wss 1kb.After recombinant plasmid were digested with BamHⅠand EcoRⅠ,we obtained two fragments:one size was 1kb,the other was 4.4kb.Western-Blot showed the fusion protein size was 38kD，and the yield of fusion protein was obviously increased at 4~6 hours by IPTG inducing.Conclusion We succeed in constructing recombinant plasmid and obtaining the fusion protein,which may provide basis for further study.
　　【Key words】 nephritis;gene;epitope;fusion protein
　　膜性腎病是兒童及成人常見難治性腎臟疾病之一，以上皮下免疫復合物的沉積致腎小球基底膜增厚和蛋白尿為特征；其發病機制尚不清楚，現有對膜性腎病的認識很多來自于其經典動物模型Heymann腎炎（HN）的研究。因此，對Heymann腎炎的分子免疫病理機制的研究將有助于提高對膜性腎病的認識，從而改進治療。
　　現已明確Megalin（也稱gp 330）是HN的主要致病抗原成分，在腎臟主要表達于近端小管的刷狀緣和腎小球上皮細胞的胞被小凹中［1,2］。它是一個跨膜糖蛋白，屬于低密度脂蛋白受體家族成員，胞外區形成4簇潛在的受體配體結合區域［3］；可與多種配體結合，包括受體相關蛋白（RAP）、血纖維蛋白溶酶原、細胞外基質成分、纖溶酶原激活因子和纖溶酶原激活因子抑制物Ⅰ型復合物、載脂蛋白E富集的β-VLDL、脂蛋白脂肪酶、乳鐵轉移蛋白以及鈣離子、胰島素等［4~7］。對Heymann腎炎中Megalin可能與RAP結合形成HN抗原復合物，再與循環中的抗體結合形成原位免疫復合物，導致腎小球的損傷和繼之的大量蛋白尿［4,8］。

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