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冠心病痰瘀證與載脂蛋白E基因多態性關系的研究
關載脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）作為脂蛋白的組成部分和功能蛋白，對血脂代謝起調節作用, 編碼ApoE基因的變異是影響血漿膽固醇濃度的重要遺傳因素之一。已有報道證實：不同遺傳背景人群的ApoE的基因多態性通過影響脂質代謝而與冠心病(coronary heart disease, CHD)的發病密切相關［1~3］。證候是中醫認識和治療疾病的根本，冠心病患者的臨床表現以血瘀證和痰瘀互阻證為多見［4］。本研究對冠心病不同證候的發生和ApoE基因多態性的相關性進行了探討，現報道如下。
1 資料與方法
1.1 病例納入標準 選擇在北京西苑醫院和北京東方醫院就診的心肌梗死患者、或經冠狀動脈造影及介入治療確診為冠心病的患者，這些患者均符合1999年美國心臟病協會AHA/WHO公布的冠心病分型和診斷標準［5］。然后對這些患者進行中醫辨證確定證候類型。痰證、血瘀證、痰瘀互阻證、氣虛證、陽虛證、陰虛證、氣滯證、寒凝證等參考國家技術監督局發布的《中醫臨床診療術語・證候部分》（國家標準GB/T16751.21997）。
1.2 病例排除標準 半年內曾有嚴重創傷或重大手術者；腎病綜合征，甲狀腺功能減退癥，急性肝膽疾病及糖尿病患者；服用藥物影響血脂代謝的患者；正在使用影響血脂代謝藥物的患者。
1.3 病例資料 按上述標準納入不同證候類型的冠心病患者共200例，其中男105例，女95例；平均年齡(63.6±5.8)歲；其中痰證20例（10%），瘀證79例（39.5%），痰瘀互阻證82例（41%），非痰非瘀證19例（9.5%）；身體質量指數（body mass index, BMI）為15.1～34.3 kg/m2。另選100名健康體檢者作為對照組，其中男55名，女45名；平均年齡(62.1±7.8)歲；均無冠心病癥狀，常規心電圖及超聲心動圖檢查正常。以上樣本人群均來自北京和河北地區，漢族，無血緣關系。所有病例均作標準基線問卷調查，結果記錄于按臨床流行病學要求設計的表格上。醫師、患者和實驗研究人員之間實行盲法。
1.4 材料
1.4.1 主要試劑 血清總膽固醇（total cholesterol, TC）和總甘油三酯（total triglycerides, TG）測定試劑盒購自法國申能公司；高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol, HDLC）和低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC）測定試劑盒由日本第一化學藥品株式會社提供；血脂測定多項質控物由衛生部臨床檢驗中心提供；全血DNA純化試劑盒（Wizard genomic DNA purification kit）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量Marker（PCR Marker和pBR322Hae Ⅲ Marker）以及限制性內切酶HhaI均購自美國Promega公司；丙烯酰胺和NN’甲叉雙丙烯酰胺，均購自北京鼎國生物技術公司。
1.4.2 血樣采集 患者空腹12 h后，靜脈抽取2 ml血樣，乙二胺四乙酸抗凝，用于提取DNA。
1.4.3 引物 根據Richard 等［6］設計引物，序列為P1：5’AACAACTGACCCCGGTGGCG 3’；P2：5’ ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC 3’，均由北京鼎國生物技術公司合成。
1.5 方法
1.5.1 血脂水平的測定 測定TG采用膽固醇氧化酶過氧化物酶4氨基安替比林和酚法；測定TC采用脂蛋白脂肪酶甘油磷酸氧化酶過氧化物酶4氨基安替比林和酚法（GPOPAP酶法）；測定HDLC采用選擇性抑制法；測定LDLC采用選擇性反應法。致動脈粥樣硬化指數（atherogenic index, AI）的計算公式為：AI=（TC－HDLC）/HDLC。
1.5.2 ApoE基因型的測定 采用全血DNA純化試劑盒提取全血DNA。按《現代心臟內科學》［5］中的條件擴增ApoE基因的目的片段。反應體系：10倍緩沖液2 μl，濃度為2 mmol/L的dNTPs 2 μl，二甲基亞砜2 μl，濃度為2 μmol/L的引物各0.25 μl，2 U Taq酶，DNA模板100～200 ng，總體積20 μl。循環條件：95 ℃預變性8 min，然后95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共35個循環后，72 ℃延伸8 min。經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）檢驗擴增結果。取10 μl PCR產物加入10倍酶切緩沖液2 μl，小牛血清0.2 μl，濃度為10 U/μl的HhaI 0.5μl，去離子水7.3 μl。37 ℃反應4 h。產物用15% PAGE檢測其基因型。
1.5.3 樣品測序 隨機選取各基因型的PCR產物送北京鼎國生物技術公司進行序列測定。
1.6 統計學方法 所有資料均采用SAS軟件包進行分析。等位基因頻率計算采用頻率記數法；基因型，基因分布頻率及基因和證候的相關性分析用χ2檢驗。不同基因型之間血脂的均數比較采用單因素方差分析。
2 結果
2.1 ApoE基因目的片段PCR擴增結果 所有300例血樣均獲得了陽性擴增條帶，目的片段分子量為292 bp。見圖1。
2.2 PCR產物HhaI酶切分型結果 在300例樣品中共檢測出6種ApoE基因型，分別為E 3/3、E 4/4、E 2/3、E 2/4、E 2/2、E 3/4型，等位基因分別為ε2、ε3和ε4。見圖2。圖3為E 4/4型的5’端正向測序結果掃描圖。將所有結果與GeneBank中已知的ApoE基因第4外顯子對應部分序列進行比對，多態性位點堿基吻合，分型結果準確。
2.3 ApoE基因型與等位基因頻率分布 CHD患者中ApoE 3/4基因型和ApoE ε4等位基因頻率明顯高于健康對照組（P<0.01, P<0.05），OR(Odds Ratio, 優勢比也稱比值比)值為2.9924，采用MantelHaenszel方法算得95％的可信區間為［1.6508, 5.4242］，使用CochranMantelHaenszel法得到P值為0.0002，表明ε4變異基因和CHD發病顯著相關。見表1。
2.4 ApoE基因多態性對血脂水平的影響 分析攜帶和不攜帶ε4等位基因患者的血脂水平，結果顯示攜帶ε4等位基因者TC、TG、LDLC和AI明顯升高（P<0.05或P<0.01）；而HDLC降低，但無統計學差異。表明ε4等位基因具有“升高血脂”的作用，可加重動脈粥樣硬化的程度和提高發病風險。見表2。
2.5 ApoE基因型與等位基因頻率在不同證候中的分布 E 3/4基因型和ε4等位基因頻率在痰證（syndrome of phlegm, PS）患者中明顯高于瘀證（syndrome of blood stasis, BSS）患者(P<0.05)，而E 3/4基因型在非痰非瘀證患者（syndrome of nonphlegm and nonblood stasis, NPNBS）中的頻率則明顯高于瘀證和痰瘀互阻證（syndrome of phlegmblood stasis blocking, PBBS）患者(P<0.05)，但未見其在ε4等位基因頻率間有統計學差異。見表3。
圖1 ApoE基因第4外顯子目的片段PCR擴增結果電泳圖（略）
Fig 1 PCR amplification results of ApoE exon 4 target fragment
M: PCR marker; 1: PCR products; 2: PCR products
圖2 ApoE基因第4外顯子目的片段PCR產物的HhaI酶切分型結果電泳圖（略）
Fig 2 HhaI RFLP results of ApoE exon 4 PCR products
M: pBR322Hae Ⅲ marker; 1: Genotype E 3/3; 2: Genotype E 2/3;3: Genotype E 2/4; 4: Genotype E 2/2; 5: Genotype E 3/4;6: Genotype E 4/4
圖3 ApoE E 4/4基因型樣品的DNA測序圖譜（略）
Fig 3 Sequence mapping of genotype E 4/4 of ApoE
表1 ApoE基因型及等位基因頻率分布（略）
Tab 1 Frequency distribution of ApoE exon 4 genotypes and alleles in CHD group and control group
*P<0.05, **P<0.01, vs control group
表 2 ε4等位基因對血脂水平的影響（略）
Tab 2 Comparison of serum lipid level between patients in CHD group with and without ε4 allele
*P<0.05, **P<0.01, vs E 2/2＋E 2/3＋E 3/3 group
表3 各證候組ApoE第4外顯子基因型和等位基因頻率分布（略）
Tab 3 Frequency distribution of apoE exon 4 genotypes and alleles in CHD patients with different syndromes
*P<0.05, vs PBBS group; △P<0.05, vs BSS group
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