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阿米卡星對豚鼠耳蝸毛細胞的損傷作用
【摘要】 目的 研究阿米卡星(amikacin，AMK)在不同給藥時間內對豚鼠耳蝸毛細胞的損傷作用，探討AMK的耳毒性。方法 豚鼠隨機分為對照組、AMK 3 d組、AMK 7 d組和AMK 11 d組。采用異硫氰酸四甲基羅丹明標記的鬼筆環肽熒光染色方法，并結合聽腦干反應(auditory brainstem response，ABR)測試，觀察用藥前后耳蝸毛細胞形態及聽功能的改變。結果 AMK首先損傷耳蝸底回的外毛細胞,并且隨著給藥時間延長，損傷逐漸向頂回發展，外毛細胞缺失明顯增多，而AMK對內毛細胞的損傷要輕于外毛細胞。聽功能改變與形態學變化基本一致。結論 AMK可損傷豚鼠耳蝸毛細胞，導致聽功能下降。
【關鍵詞】 阿米卡星;豚鼠;耳蝸;聽腦干反應
Impairment Effect of Amikacin on Cochlear Hair Cells in Guinea PigLIU Shuangyue, WANG Aimei, XU Tao, MU Hua(Department of Physiology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract:Objective To investigate the impairment effect of amikacin (AMK) on cochlear hair cells in guinea pig at different injection time, and to explore ototoxicity of AMK. Methods Guinea pigs were randomly assigned to four groups: control group, AMK 3-day group, 7-day group and 11-day group. Tetramethylrhodamine isothiocyanate-labeled phalloidine staining and auditory brainstem response (ABR) measurement were used to evaluate the changes of hair cells morphology and auditory function before and after the drug treatment. Results Outer hair cells (OHCs) in the basal turns were first impaired by AMK, and the impairment of OHCs developed to the apical turns with time prolonging, and the loss of OHCs was increased significantly. The injury of inner hair cells (IHCs) induced by AMK was lighter than OHCs. Change of auditory function was basically consistent with that of morphology. Conclusions AMK can damage the cochlear hair cells, leading to decline in auditory function.
Key words:amikacin; guinea pig; cochlea; auditory brainstem response
氨基糖苷類抗生素(aminoglycoside antibiotics，AmAn)具有強大的抗革蘭氏陰性桿菌的作用, 加之價格低廉, 是臨床控制感染的常用抗生素[1]。但是AmAn具有嚴重的耳毒性，可導致耳蝸毛細胞、前庭毛細胞及螺旋神經節細胞的損傷[2-3]。阿米卡星(amikacin, AMK)為半合成的AmAn，亦可對耳蝸毛細胞造成不可逆性的損傷[4]，然而AMK在不同給藥時間內對豚鼠耳蝸毛細胞的損傷特點及其與聽功能變化的關系，目前尚不清楚。據此，本研究應用異硫氰酸四甲基羅丹明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)標記的鬼筆環肽熒光染色方法，并結合聽腦干反應(auditory brainstem response，ABR)測試，觀察用藥前后豚鼠耳蝸毛細胞形態及聽功能的改變，以探討AMK的耳毒性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康白毛紅目豚鼠47 只，體重250～300 g，雌雄不限，耳廓反射靈敏，無中耳炎，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。實驗期間所有豚鼠均在安靜狀態下飼養并給予常規飲食。
1.2 主要試劑和儀器
阿米卡星注射液(0.1 g/mL，批號090327)由蘇州第六制藥廠生產，TRITC-鬼筆環肽購自美國Sigma公司，Smart EP & OAE聽覺誘發電位-耳聲發射記錄系統由美國智聽公司生產，ZEISS A1熒光顯微鏡由德國Zeiss公司生產。
1.3 動物分組與耳毒模型建立
將動物隨機分成4 組，即對照組10 只，AMK 3 d組11 只，AMK 7 d組12 只，AMK 11 d組13 只。以上4 組中，AMK 3 d組、7 d組和11 d組每天肌肉注射AMK 400 mg/kg，分別連續給藥3 d、7 d和11 d;對照組則每日肌肉注射等量生理鹽水。用藥期間監測動物體重以調整藥量。
1.4 ABR測試
各組動物于用藥前及停藥后24小時內分別測試ABR。操作在隔音屏蔽室內進行。豚鼠用1 %戊巴比妥鈉40 mg/ kg 經腹腔麻醉后，將電極的正極置于動物顱頂正中皮下，負極置于給聲側耳廓后下，接地電極置于對側耳廓后下，屏蔽耳機距測試豚鼠外耳道口0.5 cm。應用Smart EP & OAE聽覺誘發電位-耳聲發射記錄系統給予短純音(tone burst)刺激, 選取4、12、24 kHz 3個頻率分別進行測試并記錄ABR閾值(聽閾)。重復率39.10次/s，帶通濾波100～1 500 Hz，疊加1 024 次，掃描時程16.0 ms。聲刺激強度從95 dB SPL開始，以5 dB逐次遞減，聽閾判定以剛出現ABR Ⅲ波為準并至少重復兩次。同一刺激頻率下給藥前后的聽閾差值記為ABR閾移。
1.5 耳蝸鋪片TRITC-鬼筆環肽熒光染色
各組豚鼠于最后一次ABR測試結束后，快速斷頭，取出聽泡。解剖顯微鏡下去除鐙骨，打開前庭窗和蝸窗，用含有4%多聚甲醛的0.1 M PBS(pH 7.4)灌流3 次，并置于該溶液中4 ℃下固定24 h。然后將標本置于8 % EDTA中脫鈣2～3 d。PBS漂洗2 次后，于解剖顯微鏡下分離全耳蝸基底膜。將基底膜置于0.25% Triton X-100溶液中浸泡50 min，然后進行TRITC-鬼筆環肽染色45 min。PBS漂洗后分回鋪片，以熒光封固劑封片。熒光顯微鏡下觀察各回毛細胞損傷情況。
1.6 統計學分析
應用SPSS 16.0統計軟件包對實驗數據進行統計學分析，數據以±s表示。各組之間ABR閾移的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結 果
2.1 TRITC-鬼筆環肽熒光染色
熒光顯微鏡下觀察，可見TRITC標記的鬼筆環肽染色呈現紅色熒光，主要定位在外毛細胞(outer hair cell, OHC)和內毛細胞(inner hair cell, IHC)的靜纖毛、表皮板。此外，Deiter細胞等亦有絲狀F-肌動蛋白(F-actin)的表達。
對照組耳蝸毛細胞形態結構完好，三排OHC的纖毛呈V 形排列整齊，一排IHC的纖毛呈一形排列，耳蝸各回OHC 和IHC均無缺失(圖1 A)。AMK 3 d組耳蝸底回OHC偶有缺失，而其它回OHC以及各回IHC均無損傷(圖1B)。AMK 7 d組耳蝸底回OHC的缺失有所增多，并向上發展到第二回;IHC基本正常(圖1 C)。AMK 11 d組耳蝸底回OHC出現大量缺失并向上延伸到頂回，缺失區域被Deiter細胞取代形成網狀瘢痕;IHC出現散在損傷(圖1 D)。
2.2 ABR測試
連續給藥后，在各刺激頻率下，AMK 3 d組豚鼠的ABR閾移與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05);AMK 7 d和11 d組豚鼠的ABR閾移與對照組比較均有顯著性差異 (P<0.01)，并且隨著AMK給藥時間的延長，ABR閾移亦明顯增大(P<0.01)(圖2)。注：▲與對照組比較P<0.01，*與AMK 3 d組比較P<0.01，△與AMK 7 d組比較P<0.01
3 討 論
F-actin是一種耳蝸毛細胞骨架蛋白，具有收縮及固定靜纖毛、使OHC運動、保持毛細胞形狀以及支持和傳導等多種作用[5]。TRITC標記的鬼筆環肽是一種特殊的F-actin標記物，因此可以用于識別耳蝸毛細胞，判斷其形態變化。我們采用耳蝸基底膜鋪片，觀察到經TRITC標記的鬼筆環肽染色呈現紅色熒光，主要定位在OHC和IHC的靜纖毛、表皮板，并且在Deiters等支持細胞也有F-actin的表達。這與以往學者的觀察結果相一致[6]。
在體和離體實驗表明，AmAn引起的耳蝸毛細胞損害總是從耳蝸底回開始并逐漸向頂回發展，并且OHC的損傷要先于IHC [7]。本實驗觀察到，AMK首先損傷耳蝸底回的OHC，并且隨著給藥時間延長，OHC損傷從底回向頂回延伸，OHC缺失數量逐漸增多，而IHC的損傷要遠輕于OHC，符合AmAn耳毒性的損傷規律。丁大連等[7]125-131將bodipy標記的慶大霉素投放到耳蝸器官培養系統，觀察到OHC攝取慶大霉素的能力強于IHC，底回OHC攝取慶大霉素的能力強于頂回OHC。因此，豚鼠耳蝸頂回和底回對AMK的敏感性不同，可能與耳蝸頂回和底回OHC對AMK的攝取能力不同有關。
巴云鵬等[8]報道，豚鼠連續注射AMK 3 d之內，聽力損傷不明顯，而連續用藥6 d后，與用藥前相比ABR閾值則有顯著的變化。我們觀察到的結果與巴云鵬等的研究結果基本一致。本實驗連續注射AMK 3 d后，ABR閾移較對照組無明顯變化(P>0.05);而連續注射AMK 7 d后，ABR閾移明顯增大，并且在連續注射11 d后，ABR閾移達到最大，與形態學損傷相平行;并且隨著給藥時間的延長，AMK的耳毒性效應亦逐漸增強，呈現明顯的時效關系。此外，本實驗還觀察到，雖然AMK 3 d組豚鼠ABR閾移與對照組比較無顯著性差異，但是耳蝸底回已開始有OHC缺失，表明AMK引起耳蝸形態方面的損傷要早于聽功能的改變，同時也進一步證實了AmAn可在內耳蓄積，而最后的聽力損傷是這種蓄積的結果[7]125-131。
目前認為，AmAn可以與金屬鐵形成AmAn-鐵復合物，其具有氧化還原活性，可催化體內自由基的大量產生。過多的自由基將打破其在體內的平衡，通過激活調節細胞死亡的信號轉導途徑及其相關基因，使構成生物膜的脂質或蛋白質、核酸等生命大分子發生過氧化，從而引起耳蝸毛細胞損傷及死亡，最終導致聽力喪失。為此，人們嘗試應用依布硒啉、甲磺酸去鐵胺(deferoxamine mesylate，DFO)等抗氧化劑來防護AMK的耳毒性并取得了較好效果[4]213-217,[8]157-161，表明AMK的耳毒性亦與其促進自由基的過量生成有關。至于AMK的耳毒性損傷中，自由基通過激活哪些信號轉導途徑繼而引起耳蝸毛細胞的死亡，尚需進一步深入研究。
【參考文獻】
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