瘦素及其受體在椎間盤組織的表達及意義
【摘要】 目的 探討瘦素及其受體在椎間盤組織表達及意義。方法 采用免疫組織化學技術檢測正常椎間盤(21個)與退變椎間盤(39個)組織中瘦素及其受體的表達，用免疫細胞化學技術檢測體外培養的纖維環細胞中瘦素及其受體的表達。結果 退變椎間盤組織中瘦素及其受體的表達高于正常椎間盤組織，差異有顯著性(t=3.223、5.553,P<0.05)。體外培養的纖維環細胞中可以檢測到瘦素及其受體表達。結論 椎間盤組織存在瘦素及其受體;瘦素可能在椎間盤退變中發揮作用。
【關鍵詞】 瘦素;椎間盤;免疫組織化學
[ABSTRACT] Objective To study the expressions and their significance of leptin and leptin receptor in intervertebral disc. Methods Expressions of leptin and its receptor protein were detected in 21 normal intervertebral discs and 39 degenerative discs, and in human cells of annular fibrosus cultured in vitro, immunohistochemically and immunocytochemically, respectively. ResultsThe expressions of leptin and its receptor in degenerative discs were stronger than that of the normal discs (t=3.223,5.553;P<0.05), and that expressions could also be determined in the cells cultured in vitro. Conclusion Leptin and leptin receptor exist in the intervertebral disc tissue, which might play an important role in the process of the disc degeneration.
[KEY WORDS] leptin; intervertebral disc; immunohistochemistry
瘦素是肥胖基因編碼的肽類激素，體內許多組織中有瘦素及其受體的表達。瘦素具有很多重要的生理作用，包括調節食欲、控制體質量、調節機體炎性反應和免疫功能及促細胞增殖等[1]。瘦素在肥胖的發生過程中扮演重要的角色。同時，研究證明肥胖也是椎間盤蛻變的重要危險因素。椎間盤退變與骨性關節炎發病過程極為相似，其機制除了傳統的生物力學因素外,目前研究較多的生物化學因素可能也起著比較重要的作用�，F已證明關節軟骨細胞可以表達瘦素及其受體，并且瘦素可以刺激軟骨細胞的體外增殖，通過促進骨贅形成參與骨性關節炎的發病過程[2]，而瘦素在椎間盤退變過程中的作用報道很少。本實驗旨在探討瘦素系統在椎間盤中的表達及其在椎間盤退變發生發展中的作用。
1 材料與方法
1.1 標本及其來源
腰椎間盤標本60個,L3,4椎間盤6個，L4,5椎間盤31個，L5S1椎間盤23個。均來自于青島大學醫學院附屬醫院2008年4月—2009年1月因腰椎間盤突出癥、腰椎外傷爆裂骨折經手術治療的病人。所有病人均知情同意。病人中男27例,女24例;年齡21～59歲，平均41歲。所有病人術前均未行過硬膜外封閉、化學溶核及經皮穿刺髓核切吸術。所取標本包括纖維環和髓核。正常組21個，納入標準為：①術前MRI顯示所取的椎間盤組織T2加權像上Pfirrmann分級Ⅰ～Ⅲ級;②術前無神經根刺激癥狀。退變組39個，納入標準為：①術前MRI顯示所取的椎間盤組織T2加權像Pfirrmann 分級Ⅳ～Ⅴ級;②術前存在明顯神經根刺激癥狀。各標本取出后置于40 g/L甲醛溶液中固定,Carnoy 液4 ℃過夜,不同梯度的乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。4～5 μm厚連續切片,以備蘇木精?伊紅染色和免疫組化檢測用。
1.2 方法
1.2.1 切片光鏡觀察 用蘇木精?伊紅常規染色。
1.2.2 免疫組織化學染色 瘦素兔抗人多克隆抗體和瘦素受體羊抗人多克隆抗體購自Santa Cruze公司;Immunostain SP Kit試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。載玻片均經多聚賴氨酸浸泡24 h防脫片處理,60 ℃烤箱烘烤干燥。切片常規進行脫蠟、阻斷內源性過氧化酶的活性、抗原修復和封閉，采用SP法進行免疫組織化學染色，DAB顯色。實驗中采用PBS代替一抗作為陰性對照，以脂肪組織的染色結果作為陽性對照。結果判定：瘦索及其受體表達陽性物質位于細胞內，陽性結果為棕黃色。每張切片隨機選取纖維環區域10個高倍鏡視野，計數每個視野的陽性細胞數，再將10個高倍鏡視野細胞數相加，得出每個樣本陽性纖維環細胞數。
1.2.3 纖維環細胞培養 椎間盤標本取自25歲男性腰椎間盤突出癥病人，在離體30 min內取回實驗室。仔細分離出纖維環組織， 把纖維環組織剪成1 mm大小的碎塊，用胰蛋白酶及膠原酶消化后，細胞用HAMF?12培養液沖洗3次，低速離心5 min，計數板進行細胞計數。將細胞接種于培養瓶內，置于培養箱中進行培養。細胞爬片行蘇木精?伊紅染色，見細胞為梭形或多角形，胞核卵圓形，胞漿淡染。然后進行瘦素檢測：40 g/L多聚甲醛固定10 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;2 g/L TritonX?100透化，室溫5 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;封閉液阻斷，室溫60 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;滴加兔抗人瘦素一抗，37 ℃ 1 h;PBS沖洗3次，每次3～5 min;滴加山羊抗兔IgG抗體，37 ℃ 30 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;滴加HRP，37 ℃ 30 min;PBS沖洗3次，每次3～5 min;DAB顯色15 min，封片，觀察。同法檢測瘦素受體。
1.3 統計學處理
所測數據采用±s表示, 以微軟公司Excel 2000 Student test作樣本均數t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。
2 結 果
2.1 蘇木精?伊紅染色
退變組椎間盤組織表現為膠原纖維增多，排列紊亂，血管組織浸潤，纖維環板層狀結構破壞，肉芽組織形成。正常組均表現為纖維環板層狀結構明顯，軟骨細胞多見，且較均勻，基質較少。
2.2 瘦素及其受體在椎間盤組織表達
正常椎間盤組織，瘦素在纖維環中表達較均勻，從纖維環外層向內層表達逐漸減弱，而在髓核的軟骨樣細胞中無表達;退變椎間盤纖維環細胞中瘦素表達增強，且不均勻，以細胞簇及纖維軟骨細胞增生的區域明顯，髓核細胞無表達。瘦素受體的表達情況與瘦素相似。退變組與正常組比較差異有顯著意義(t=3.223、5.553，P<0.05)，見表1�！ ”�1 兩組瘦素及其受體的表達情況
2.3 瘦素及其受體在體外纖維環細胞中的表達
體外培養的纖維環細胞中可以檢測到瘦素及其受體的表達，位于細胞漿內。
3 討 論
人群中椎間盤退變現象相當普遍。退變椎間盤的組織學特點包括髓核脫水，糖蛋白降解，纖維環的板層狀結構破壞等。椎間盤蛻變的危險因素包括吸煙、飲酒、遺傳因素、過勞、糖尿病、高血壓等，這些因素導致了椎間盤細胞代謝水平的改變，干擾椎間盤細胞增殖與凋亡的平衡[3]。使得椎間盤中一些炎性遞質過表達，影響椎間盤的修復能力。最終導致椎間盤蛻變。
近來肥胖與椎間盤退變的關系備受關注，大量研究證明肥胖在椎間盤退變過程中發揮作用。但肥胖促進椎間盤退變的確切機制尚不清楚，純機械應力因素難以解釋肥胖與椎間盤蛻變之間的關聯。瘦素作為一種脂肪因子于1994年發現，繼而瘦素的作用被廣泛研究。瘦素通過與中樞神經系統及周圍器官的瘦素受體直接結合來調節體內的能量平衡、脂肪代謝及某些內分泌功能，并可能參與了骨與軟骨的發育過程[4]。瘦素受體是一單跨膜的細胞表面受體，它至少由5種異構形式，其中只有長型受體OB?Rb具備完整的胞內區而具有信號轉導功能，它屬于Ⅰ級細胞因子受體家族，可以激活酪氨酸蛋白激酶家族的信號轉導子和轉錄激活子，故稱為功能性受體。瘦素受體在大腦脈絡叢、下丘腦、肝臟、胰臟、肺臟、腎臟、關節軟骨等多個部位均有表達[5]，此與瘦素具有廣泛的生物學效應有關。最近研究發現，瘦素是一種有絲分裂促進劑。它能夠顯著促進T淋巴細胞、角朊細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、軟骨細胞等多種細胞的生長增殖。瘦素還具有抗T細胞、單核細胞、成神經瘤細胞、海馬神經元細胞凋亡作用[6]。同時，瘦素作為一種細胞因子樣激素在免疫系統中所發揮的作用越來越受到關注。它可為血細胞和淋巴細胞的生成提供增殖信號，活化單核細胞、吞噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞，調節T、B細胞介導的適應性免疫應答，促進細胞因子的合成，刺激炎性反應，而且作為一種新型的免疫調節因子，瘦素在多種自身免疫病中也發揮重要作用。
目前認為椎間盤退變的關鍵因素為椎間盤在纖維環反復損傷后引起損傷修復的炎癥反應，導致巨噬細胞和肥大細胞聚集，釋放大量的細胞因子，使椎間盤內的細胞增生和分化，血管、神經和纖維沿撕裂的纖維環裂隙長入，最終導致椎間盤退變。組織學上病理椎間盤中存在自纖維環外層到內層的肉芽組織條帶區，對應于腰椎間盤造影術顯示的裂隙。正常椎間盤僅纖維環表層有血管分布，這些肉芽組織條帶區最可能起源于外層纖維環的機械性創傷和隨之的創傷修復過程。
瘦素可直接參與創傷組織的修復過程，其與促進創傷修復細胞因子結構上的相似性提供了瘦素可能參與創傷愈合反應的物質基礎，瘦素調控血管生成及免疫反應的外周作用也與創傷愈合過程關系密切[7]。 MURAD等[8]認為，瘦素由于在組織修復時促進了新血管的生成從而參與了傷口組織修復的調控。他們發現不僅肉芽組織中的免疫細胞及修復細胞有瘦素受體的表達，而且皮膚組織受損后傷口中的細胞就積極參與瘦素的合成，說明瘦素是創傷愈合過程的自分泌或旁分泌調節物。 本研究中體外培養的纖維環細胞中同時檢測到瘦素及其受體的表達，提示椎間盤細胞生長增殖過程中可能存在自分泌或旁分泌機制。
綜上所述，椎間盤組織中有瘦素系統的表達，蛻變椎間盤組織中瘦素表達的程度與模式均與正常椎間盤有明顯差異，并且體外培養的細胞同時檢測到瘦素及其受體的表達。提示瘦素系統很有可能通過自分泌或旁分泌機制參與了椎間盤蛻變過程。瘦素系統有可能成為椎間盤退變生物學治療新的靶點。
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