葡萄胎組織MMPs與TIMPs表達及意義

葡萄胎組織MMPs與TIMPs表達及意義

【關鍵詞】  基質金屬蛋白酶類 基質金屬蛋白酶組織物抑制物 葡萄胎
 ［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the expressions of MMPs and TIMPs in hydatidiform mole and their clinical significance.MethodsThe mRNA expressions of MMPs and TIMPs were detected by RT?PCR in tissue of hydatidiform mole (n=35) including six malignant transformed mole and normal villi (n=18).ResultsThe ratios of MMP?9/TIMP?1 mRNA expressions were significantly higher in the malignant transformed mole than those in the nonmalignant one and normal villi（F=3.62,q=3.82,3.57,P<0.05）. The differences in expressions of MMPs and TIMPs were not significant in all cases (P>0.05). Positive correlation between MMP?7 and MMP?9 expression was noted (r=0.985,P<0.01).ConclusionIt is certain that the ratios of MMP?9/TIMP?1 mRNA expression plays a role in predicting malignancy of hydatidiform mole.
    ［KEY WORDS］matrix metalloproteinases; tissue inhibitor of matrixnetalloproteinases; hydatidiform mole
    葡萄胎屬于良性腫瘤，但是它具有潛在惡變的性能，雖然長期備受學者們的關注，但目前為止仍無理想的預測惡變的方法。雖然血絨毛膜促性腺激素（HCG）可作為一種較敏感的標志物用于預測葡萄胎的惡變，但是它有一定的滯后性。而基質金屬蛋白酶（MMPs）幾乎可降解細胞外基質（ECM）中除多糖以外的所有成分,是調節ECM動態平衡的最重要的一大酶系。基質金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs) 能與相應的MMPs 酶原及其活化形式結合,從而抑制MMPs的活性及產生,阻止腫瘤發生惡變和轉移，因此，TIMPs的調節失衡在腫瘤的侵襲及轉移中可能起重要作用。本研究通過檢測基質金屬蛋白酶及其抑制物MMP?7、MMP?9、TIMP?1及TIMP?2 mRNA在正常絨毛和葡萄胎組織中的表達水平，探討它們與葡萄胎惡變間的關系，為臨床治療提供依據。
    1  資料與方法
    1.1  一般資料
    35例葡萄胎病例均為2001年1月～2003年1月在青島大學醫學院附屬醫院住院病人，經病理檢查診斷為葡萄胎，清宮前均未進行預防性化療；病人年齡22～36歲，中位年齡28歲；平均孕周為12周；隨訪期間有6例惡變為侵蝕性葡萄胎，其診斷參照宋鴻釗[1]提出的侵蝕性葡萄胎的診斷標準，列為葡萄胎惡變組（A組），其余病人作為萄胎未惡變葡組（B組）。18例行人工流產健康婦女作為對照組，隨訪后未發生滋養細胞疾病或持續性血HCG升高；病人年齡23～36歲， 中位年齡28歲；平均孕周為12周。
    1.2  方法
    1.2.1  新鮮標本的收集與處理  所有標本均在清宮時收集，取宮腔小水泡組織約0.5 g，置于 1.5 mL DEPC處理EP管中，立即置-79 ℃冰箱中備用。 
    1.2.2  RT?PCR方法  所有引物均由上海生工生物有限公司合成，以GAPDH為內參照。組織樣本勻漿破碎后，按照Trizol（Invitrogen公司）說明提取總RNA，用紫外分光光度計測定RNA樣品于波長260和280 nm處的吸光度，以觀察所提取RNA樣品的純度，并計算其含量；取1 g總RNA按照PromegaA3500逆轉錄試劑盒說明合成cDNA；取3 μL 逆轉錄產物，2.5 μL buffer,1.5 μL MgCl2,0.5 μL dNTP,上下游引物各1.25 μL，Taq酶0.2 μL，最后加入去離子水至25 μL。開始94 ℃變性5 min，然后94 ℃預變性30 s；MMP?9、MMP?7、TIMP?1及TIMP?2分別行54、57、53、57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；取5 μL PCR產物，1 μL上樣緩沖液于20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳60 min，在紫外線下凝膠成像。
    1.2.3  表達結果判斷標準  PCR產物半定量分析,用天能GIS凝膠圖像分析系統掃描凝膠，進行吸光度掃描和測定灰度值。以GAPDH 作為內參照校正, 用目的基因與GAPDH灰度比值作為目的基因的相對表達含量。
    2  結    果
    2.1  MMPs與TIMPs mRNA在各組織中的表達
    2.1.1  RNA樣品鑒定  所提標本的RNA濃度在0.5～5.0 g/L之間，A260/A280在1.8～2.0之間，20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳RNA可見3條清晰的條帶（圖1～4）。
    2.1.2  MMPs與TIMPs mRNA在各組織中的相對表達  各組MMP?9、MMP?7、TIMP?1、TIMP?2的mRNA表達水平差異無顯著意義（P>0.05）。MMP?9/TIMP?1比值在各組中的表達差異有顯著性（F=3.62，P<0.05）；A組中MMP?9/TIMP?1比值分別高于B組和對照組，差異有顯著意義（q=3.82、3.57,P<0.05）。表1  各組組織中 MMPs與TIMPs mRNA的相對表達水平
    2.2  各指標間的相關性分析
    經Pearson相關性分析顯示，在所有組織中MMP?9與MMP?7表達呈正相關(r=0.985,P<0.01)，MMP?9與TIMP?1表達也呈正相關(r=0.616,P<0.01)。
    3  討    論
    預測葡萄胎是否惡變是葡萄胎治療中一個極為重要的問題，此問題長期以來備受學者們的關注，此方面的研究也不少，但仍無理想的預測惡變的方法。目前臨床上普遍將年齡大于40歲，清宮前子宮大于正常妊娠月份，卵巢黃素化囊腫直徑大于6 cm,清宮前血HCG>100 kU/L列為葡萄胎惡變的高危因素[2]，但不是惟一因素。當存在上述惡變高危因素時，葡萄胎易發生惡變，但由于準確性不高，影響到對預防性化療的評價。研究表明，滋養細胞和腫瘤細胞的侵入過程具有相似性，葡萄胎惡變為侵蝕性葡萄胎的過程中，必須多次溶解血管內皮基底膜，其中MMPs和TIMPs動態平衡失調在此過程中可能起到了非常重要的作用。已有學者研究了MMPs和TIMPs在子宮內膜異位癥發生發展中的作用，結果顯示，MMP?1/TIMP?1比例失衡使異位內膜組織具有更強的侵襲能力，可能在該病的發生發展中起重要作用[3]。
    本文研究結果顯示，MMP?9、MMP?7、TIMP?1、TIMP?2在各組中的表達均無顯著性差異，這可能是因為正常孕早期絨毛組織也可分泌MMPs,分解子宮內膜基底膜,有利于胚泡植入和胎盤形成,同時又受到TIMPs在時間和空間上的嚴格限制；良性葡萄胎是局限在宮腔內，并非浸潤，與正常絨毛侵蝕子宮內膜過程相仿，因此，他們分泌的MMPs與TIMPs無差異性。而侵蝕性葡萄胎關鍵在于侵蝕，MMPs在其侵蝕過程中起重要作用。本研究結果顯示，葡萄胎惡變組的MMPs與TIMPs雖略高于正常絨毛組和葡萄胎未惡變組，但差異無統計學意義。TIMP?1是MMP?9的特異性抑制因子。本研究結果顯示，MMP?9與TIMP?1呈正相關，說明隨著MMP?9表達的升高，TIMP?1表達也升高，而不是降低。因此，雖然MMPs與TIMPs分別在各組中的表達差異無統計學意義，但MMP?9/TIMP?1比值在葡萄胎惡變組中的表達明顯高于正常絨毛組和葡萄胎未惡變組，差異有顯著性,而在正常絨毛組和葡萄胎未惡變組中的表達差異無顯著性。因此，可以認為MMPs與TIMPs比例失衡即TIMP?1比值升高在葡萄胎的惡變過程中可能起重要作用。

   MMP?7又稱基質溶解素。研究表明，MMP?7表達量的增高，不僅有助于腫瘤細胞的擴散和轉移，還有助于腫瘤血管的形成[4]。由于滋養細胞可以取代血管內皮細胞形成血管內皮層， MMP?7在妊娠滋養細胞疾病中的主要作用可能是協助滋養細胞取代血管內皮細胞，參與血道轉移。MMP?7可以激活MMP?9，許多學者聯合這兩個指標來檢測他們在腫瘤細胞中的表達及其意義。TANIOKA等[5]研究MMP?7、MMP?9與早期食管癌預后的相關性顯示，MMP?7的表達主要與淋巴結轉移有關，MMP?9表達主要與腫瘤浸潤深度、淋巴浸潤、淋巴結轉移和病理分期有關，在出現浸潤之前就有MMP?7、MMP?9的聯合表達可能與預后有關。MISUGI等[6]研究了MMPs和TIMPs在子宮內膜癌組織中的表達，顯示MMP? 7在分級高的腫瘤中比分級低的腫瘤中表達高，在分級高的子宮內膜癌中MMP? 7表達升高可能與腫瘤的浸潤、轉移有關。本研究經相關性分析表明，MMP?7表達增多時，MMP?9表達也增多，這從基因水平表明了兩者呈正相關，且關系密切，在葡萄胎出現惡變之前就有MMP?7及MMP?9聯合表達升高，提示可能是葡萄胎惡變的早期表現。
    總之，本文通過比較各組中MMPs及TIMPs的mRNA表達水平顯示，雖然在有惡變傾向的葡萄胎中的表達均略高于良性葡萄胎和正常絨毛，但差異無顯著性；而MMP?9/TIMP?1比值在葡萄胎惡變組中的表達高于正常絨毛組和葡萄胎未惡變組,因此認為MMP?9/TIMP?1比值可望作為判斷葡萄胎預后的一項參考指標，特別是對葡萄胎有惡變傾向的病人進行預防性化療可提供理論依據。
 
【參考文獻】
  [1]宋鴻釗. 滋養細胞腫瘤的診斷和治療[J].北京：人民衛生出版社, 2004：88?92.

[2]樂杰. 婦產科學[M]. 第6版.北京：人民衛生出版社, 2003:319?329.

[3]婁艷輝,錢金花,郭新華. MMP?1及TIMP?1在異位內膜組織中的表達[J]. 齊魯醫學雜志， 2004,19(5):392?393.

[4]LIU X P, KAWAUCHI S, OGA A, et al. Prognostic significance of matrix metalloproteinase?7 (MMP?7) expression at the invasive front in gastric carcinoma[J]. Cancer Research, 2002,93(3):291?295.

[5]TANIOKA Y, YOSHIDA T, YAGAWA T, et al. Matrix metalloproteinase?7 and matrix metalloproteinase?9 are associated with unfavorable prognosis in superficial oesophageal cancer[J]. Br J Cancer, 2003,89(11):2116?2121.

[6]MISUGI F, SUMI T, OKAMOTO E, et al. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinase in uterine endometrial carcinoma and a correlation between expression of matrix metalloproteinase?7 and prognosis[J]. Int J Mol Med, 2005,16（4）：541?546.

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