硝酸甘油減輕對乙酰氨基酚肝毒性的作用與機制
作者：任利君 彌曼 寧養紅 李汾 李新華【摘要】 目的: 研究硝酸甘油(GTN)對對乙酰氨基酚（AP）肝毒性的影響與機制. 方法： 小鼠ip GTN 0.1~1.6 mg/kg，15 min后ip AP 300 mg/kg，6 h后測定血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)；GTN（1.6 mg/kg）預處理小鼠，測定AP半數致死量（LD50）；熒光法測定肝蛋白S?亞硝基化水平；分光光度法測定肝谷氨酸脫氫酶(GDH)活性；S?亞硝基谷胱甘肽（GSNO）處理GDH純酶，Saville?Griess法測定其S?亞硝基化水平，并觀察對N?乙酰?p?苯醌亞胺（NAPQI）滅活GDH效應的影響. 結果： GTN降低AP導致的ALT，AST升高，使AP對小鼠LD50由321 mg/kg上升至762 mg/kg；GTN引起肝蛋白S?亞硝基化水平升高，使AP對肝GDH的抑制作用完全消失；GSNO誘發GDH純酶發生S?亞硝基化，且不影響酶活性，但修飾后的GDH不被NAPQI滅活. 結論： GTN可減輕AP肝毒性，其機制與誘發肝蛋白巰基S?亞硝基化，減少NAPQI與蛋白（如GDH）巰基的共價結合有關.
【關鍵詞】 對乙酰氨基酚；硝酸甘油；S?亞硝基化；谷氨酸脫氫酶；肝毒性；肝/藥物作用
0引言
對乙酰氨基酚(acetaminophen, AP)過量致肝實質細胞向心性壞死是西方國家急性肝功能衰竭的首要病因［1］．目前認為，過量AP經肝P450酶系代謝活化，產生N?乙酰?p?苯醌亞胺［N?acetyl?p?benzoquinone imine,(NAPQI)］，后者迅速與還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的巰基結合，使其耗竭后進而與蛋白巰基結合，破壞蛋白功能而引發毒性. 補充GSH是較為滿意的防治措施［1］. 本研究選用硝酸甘油（glyceryl trinitrate，GTN)誘導肝蛋白巰基發生S?亞硝基化修飾［2］，以保護蛋白巰基，減少或避免NAPQI攻擊，觀察是否可減輕AP肝毒性.
1材料和方法
1.1材料AP，NAPQI，2,3?二氨基萘（2,3?diaminonaphthalene, DAN），Griess試劑，牛肝谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)(美國Sigma公司)；5?磺基水楊酸（5?sulfosalicylic acid，SSA），GSH，氯化汞（HgCl2），亞硝酸鈉(美國Amresco公司)；谷丙轉氨酶（ALT），谷草轉氨酶（AST）活性測定試劑盒（寧波亞太生物技術有限公司）；GTN注射液（山東華信制藥有限公司）；超濾管（美國Millipore公司）；預裝脫鹽柱，熒光分光光度計，紫外分光光度計(美國Bio?rad公司)．雄性昆明小鼠，體質量18~20 g，由西安交通大學實驗動物中心提供.
1.2方法
1.2.1動物實驗方案實驗一:80只小鼠，禁食不禁水10 h，隨機分為8組，每組10只，分別ip給藥：GTN(0.1, 0.4, 1.6 mg/kg)，AP(300 mg/kg)，GTN+AP（先注射GTN，15 min 后注射AP），對照組ip等體積生理鹽水. 給藥后6 h摘眼球取血，制備血清，按照試劑盒說明書測定ALT和AST活性；同時取肝臟，稱質量后剪碎，以5倍體積50 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)勻漿，1000 g離心10 min，保留上清，取100 μL 測定GDH催化活性，其余樣品脫鹽后測定蛋白S?亞硝基化水平. 實驗二：測定LD50，采用140只小鼠，隨機分為14組，每組10只，禁食15 h，其中7組ip GTN 1.6 mg/kg，另7組ip等體積生理鹽水，15 min后均ip AP：生理鹽水組AP劑量分別為800，571，408，292，208，149，106 mg/kg，GTN預處理組AP劑量分別為1500，1071，765，547，390，279，199 mg/kg；AP加熱至50℃溶解，給藥容積為15 mL/kg；觀察給藥后24 h內各組小鼠死亡率，計算LD50.
1.2.2GDH催化活性測定按照文獻［3］進行.
1.2.3熒光法測定肝蛋白S?亞硝基化水平蛋白濃度調整為5 g/L，取1 mL進行實驗，樣品等分為二，一份加入HgCl2分解S?亞硝基化蛋白，釋放一氧化氮（nitric oxide, NO）與DAN（溶解于0.62 mol/L HCl）反應，生成熒光物質，另一份加入HgCl2的溶劑作為對照，樣品調pH為中性后加SSA沉淀蛋白，離心取上清，測定熒光強度，激發波長380 nm，吸收波長450 nm，以亞硝酸鈉做標準曲線，折算蛋白S?亞硝基化水平［4］.
1.2.4S?亞硝基谷胱甘肽（S?nitrosoglutathione，GSNO）的合成與定量200 mmol/L亞硝酸鈉與200 mmol/L GSH（均溶解于0.5 mol/L HCL）等體積混合，室溫避光反應5 min，得紅色產物，用1 mol/L NaOH調pH至中性，以消光系數定量［5］.
1.2.5GDH與GSNO及NAPQI反應GDH透析除去硫酸銨，蛋白濃度調整為1 g/L，取1 mL與等體積GSNO（終濃度0，20，200，2000 μmol/L）室溫避光反應30 min，采用脫鹽柱去除過量GSNO，一半樣品用于測定GDH催化活性，并以Saville?Griess法測定酶蛋白S?亞硝基化水平［6］，剩余樣品調整蛋白濃度為0.25 g/L，取1 mL加入NAPQI 1 μL，使其終濃度為10, 30, 90 μmol/L， 室溫反應30 min，利用超濾管進行脫鹽濃縮，測定GDH催化活性與S?亞硝基化水平［6］；上述實驗均重復5次.
統計學處理：數據以x±s表示，用SPSS 13．0軟件包進行方差分析(ANOVA)，多重比較采用LSD?t檢驗法，組間方差不齊時，采用非參數秩和檢驗法，采用Bliss法計算LD50.
2結果
2.1GTN改善AP導致的血清生化指標改變小鼠單獨注射AP 300 mg/kg，血清ALT和AST較對照組均升高（P<0.05）；單獨注射GTN，各劑量組均不影響ALT和AST活性；GTN與AP合用，血清AST和ALT較單用AP降低（P<0.05），但與對照組比較，ALT和AST仍偏高（P<0.05，表1）. 在GTN劑量方面，預實驗發現，GTN劑量達到50 mg/kg時，小鼠全部死亡；劑量小于0.05 mg/kg時，保護作用幾乎消失；劑量大于2.0 mg/kg 時, 保護作用逐漸減弱. 表1硝酸甘油和對乙酰氨基酚對小鼠血清生化指標的影響
2.2GTN成倍提高AP的LD50選用GTN保護作用最強的劑量1.6 mg/kg，測定預處理對AP LD50的影響，發現單用AP對小鼠的LD50為321 mg/kg，95%可信限為(262～394）mg/kg，而GTN預處理后，AP的LD50升高至762 mg/kg，95%可信限為(618～969）mg/kg.
2.3GTN對肝蛋白S?亞硝基化水平和GDH酶活性的影響正常小鼠肝臟（對照組）存在一定量的S?亞硝基化修飾蛋白，AP處理后其水平未見統計學變化，而GTN預處理使其較對照組升高（P<0.05），GTN與AP合用組S?亞硝基化水平也高于對照組（P<0.05）；單獨AP給藥使肝組織GDH催化活性明顯降低（P<0.05），單獨注射GTN對GDH催化活性沒有明顯影響，而GTN與AP合用時，GDH催化活性較單用AP升高（P<0.05，表2）. 表2硝酸甘油和對乙酰氨基酚對肝蛋白S?亞硝基化水平及GDH活性的影響(
2.4GSNO誘導GDH純酶發生S?亞硝基化并保護其不被NAPQI滅活GDH純酶與生理鹽水（對照）體外孵育，用Saville?Griess法檢測不到S亞硝基化修飾， 與GSNO孵育反應后，GDH發生了S?亞硝基化修飾，但該修飾并不影響酶催化活性；AP代謝產物NAPQI明顯抑制GDH純酶的催化活性(P<0.05)；而GSNO(200 μmol/L)預處理可完全對抗NAPQI的抑制作用（表3）. 表3GSNO和NAPQI對GDH純酶的修飾及功能影響 3討論
本研究表明，GTN可減輕AP肝毒性，這對臨床合理、安全用藥具有一定地指導意義. AP是應用廣泛的解熱鎮痛藥，多種抗感冒復方制劑均含有AP，服用這類藥物具有潛在的肝毒性. 本研究結果提示，同時服用GTN可望降低該風險；短期服用GTN幾乎沒有副作用，因而二者合用不會增加新的不良反應；尤其對于經常服用GTN的心血管病患者，提醒其服用GTN后再服用含AP的各種制劑，可能會對患者有所裨益. 必需指出，本研究動物實驗的結果尚不能直接外推到臨床用藥，但可為相關臨床試驗提供一定理論依據.
AP肝毒性的機制主要與蛋白巰基被破壞有關，例如GDH的巰基可與NAPQI結合而導致酶活性降低［7］. 本研究發現，一氧化氮供體GSNO在體外可誘導GDH發生巰基S?亞硝基化，防止其被NAPQI滅活，同時GTN也可防止GDH在體內被AP滅活，提示GTN降低AP肝毒性的作用機制與誘發肝蛋白發生巰基S?亞硝基化，保護巰基以維持蛋白正常功能有關.
GTN減輕 AP肝毒的作用與機制，可望揭示一種全新的肝細胞保護機制. 文獻報道，肝組織靶向性的外源NO供體以及內源性過量產生的NO，均可減輕AP肝毒性，但其作用機制尚未完全明確，本研究提示NO可能通過增加蛋白S?亞硝基化、減少NAPQI共價結合而發揮護肝作用. 另外，在半乳糖胺誘發的肝細胞損傷過程中，伴隨有顯著的蛋白S?亞硝基化升高［8］，但其生物意義不明確，本研究提示，這種應激性的S?亞硝基化升高，可能是機體的一種自發保護機制.
本研究結果顯示GDH是一個全新的S?亞硝基化蛋白靶點，但該修飾并不影響其催化活性. 此前報道的諸多蛋白靶點，均可通過S?亞硝基化修飾而調控功能改變［9］，而不影響功能的修飾往往被忽視，迄今尚未見任何文獻報道. 本研究表明，不影響蛋白功能的S?亞硝基化同樣具有重要生物學意義，可保護巰基，使其不受有毒活性物質攻擊，維持蛋白在應激狀態下的正常功能，這對S?亞硝基化研究領域提供了新的思路.
【參考文獻】
［1］ Amar PJ, Schiff ER. Acetaminophen safety and hepatotoxicity?where do we go from here?［J］ . Expert Opin Drug Saf, 2007, 6(4):341-355.
［2］ Janero DR, Bryan NS, Saijo F, et al. Differential nitros(yl)ation of blood and tissue constituents during glyceryl trinitrate biotransformation in vivo［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(48):16958-16963.
［3］ Kanavouras K, Mastorodemos V, Borompokas N, et al. Properties and molecular evolution of human GLUD2(neural and testicular tissue?specific) glutamate dehydrogenase［J］. J Neurosci Res, 2007, 85(5) :1101-1109.
［4］ Park JK, Kostka P. Fluorometric detection of biological S?nitrosothiols［J］. Anal Biochem, 1997, 249(1) :61-66.
［5］ Mathews WR, Kerr SW. Biological activity of S?nitrosothiols: The role of nitric oxide［J］. J Pharmacol Exp Ther, 1993, 267(3) :1529-1537.
［6］ Hao G, Derakhshan B, Shi L, et al. SNOSID, a proteomic method for identification of cysteine S?nitrosylation sites in complex protein mixtures［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(4) :1012-1017.
［7］ Halmes NC, Hinson JA, Martin BM, et al. Glutamate dehydrogenase covalently binds to a reactive metabolite of acetaminophen［J］. Chem Res Toxicol, 1996, 9(2) :541-546.
［8］ López?Sánchez LM, Collado JA, Corrales FJ, et al. S?Nitrosation of proteins during D?galactosamine?induced cell death in human hepatocytes［J］. Free Radic Res, 2007, 41(1) :50-61.
［9］ 陳暢, 黃波, 韓佩韋, 等. 蛋白質巰基亞硝基化——一種典型氧化還原依賴的蛋白質翻譯后修飾［J］. 生物化學與生物物理進展, 2006, 33(7):609-615.
【硝酸甘油減輕對乙酰氨基酚肝毒性的作用與機制】相關文章：
股東訴訟機制作用與現狀研究12-11
論文化導入機制的建立對語言學習的作用11-27
淺談城鎮化對經濟發展的作用機制論文03-07
黏附分子在系統性紅斑狼瘡發病機制中的作用12-10
關于學生社團對大學生社會化的作用機制及建設路徑研究11-30
怎樣減輕學生的課業負擔12-06
人參皂苷Rg1激活PI3K/Akt信號通路對6?OHDA毒性作用的影響01-18
淺談公司外部治理機制研究12-01
- 相關推薦