人參皂苷Rg1激活PI3K/Akt信號通路對6?OHDA毒性作用的影響

人參皂苷Rg1激活PI3K/Akt信號通路對6?OHDA毒性作用的影響

【摘要】  目的 探討人參皂苷Rg1對抗6?羥基多巴胺(6?OHDA)毒性作用的信號通路。方法 MES23.5細胞常規培養，免疫印跡法觀察人參皂苷Rg1預處理對6?OHDA誘導的磷酸化蛋白激酶B (Akt) 表達的影響，MTT法觀察細胞的存活率。結果 6?OHDA可時間依賴性地降低MES23.5細胞磷酸化Akt的表達(F=24.51,P<0.01)，人參皂苷Rg1預處理可明顯增強磷酸化Akt的表達(t=471.60,P<0.01);人參皂苷Rg1預處理可明顯降低6?OHDA對MES23.5細胞的損傷作用，此作用可以被磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特異性抑制劑LY294002所阻斷(F=25.12,P<0.01)。結論 人參皂苷Rg1通過激活PI3K/Akt信號通路對抗6?OHDA對MES23.5神經細胞的毒性作用。 
【關鍵詞】  人參皂甙;羥多巴胺;毒性作用;蛋白激酶B;神經元
[ABSTRACT] Objective To study the signaling pathway involved in the protective effect of ginsenoside Rg1 against 6?OHDA?induced toxicity. Methods MES23.5 cells were routinely cultured and the effect of ginsenoside Rg1 against the 6?OHDA induced Akt phosphorylation was detected by western blot method, and the cell survival observed by MTT method. Results 6?OHDA inhibited the Akt phosphorylation in a time?dependent manner in MES23.5 cells (F=24.51,P<0.01). Pretreatment with ginsenoside Rg1 could increase the Akt phosphorylation (F=12.37,P<0.01). Pretreatment with ginsenoside Rg1 could decrease the 6?OHDA?induced toxicity in MES23.5 cells and these effects could be completely blocked by the PI3K inhibitor LY294002 (t=471.60,P<0.01). Conclusion Ginsenoside Rg1 protects against 6?OHDA?induced neurotoxicity via the activation of the PI3K/Akt signaling pathway in MES23.5 cells.
　　[KEY WORDS] Ginsenoside; Oxidopamine; Toxic actions; Casein kinase B; Neurons
　　帕金森病(PD)是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，其主要的病理改變是中腦黑質致密帶(SNzc)多巴胺(DA)能神經元功能障礙[1,2]。PD的病因迄今未明，發病機制十分復雜，研究認為可能與氧化應激、興奮性毒素、線粒體功能障礙、細胞凋亡等機制密切相關。目前對PD的治療手段不斷發展，可分為藥物治療、基因治療和外科治療等，但藥物治療長期應用后的副作用、外科手術治療的昂貴及遠期療效的不確定性，使得各國學者試圖從不同的角度入手，探尋新的治療方法。人參皂苷是人參的主要活性成分，包含有30多種人參單體，如Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc等，Rg1在人參皂苷中的含量豐富。近年來的研究顯示，人參皂苷Rg1具有多種生物活性[3,4]，特別是在中樞神經系統，Rg1具有神經營養和神經保護作用。本研究室的前期實驗已揭示Rg1可以對抗6?OHDA對MES23.5神經元的損傷[5]，為了進一步探討人參皂苷Rg1對抗6?OHDA毒性作用的機制，本研究應用6?OHDA損傷MES23.5神經細胞，建立PD細胞模型，并應用人參皂苷Rg1進行干預，從細胞和分子水平探討6?OHDA誘導神經毒性的信號途徑以及Rg1的保護效應，以期為人參皂苷Rg1的神經保護作用機制提供進一步的實驗依據。
　　1 材料與方法
　　1.1 試劑及其來源
　　純度為99.9%人參皂苷Rg1購自白求恩醫科大學;DMEM/F12培養基購自Invitrogen公司(美國);6?OHDA購自Sigma公司(美國);抗Akt抗體購自Santa Cruz公司(美國);抗磷酸化Akt抗體購自購自Cell signaling公司(美國);LY294002購自Tocrics公司(美國);ECL化學發光試劑盒購自Promega公司(美國);噻唑藍(MTT)和胎牛血清均購自Gibco BRL公司。MES23.5細胞由樂衛東教授提供(美國貝勒醫學院)。
　　1.2 細胞培養及藥物處理
　　MES23.5細胞接種于96孔板或6孔板，用含體積分數0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培養基，于37 ℃、體積分數0.05的CO2條件下培養。當細胞融合達80%～90%時，分別用在有或無LY294002 (10 μmol/L)存在的情況下，應用Rg1(10-8mol/L)預保護24 h,然后再給予6?OHDA(100 μmol/L)，共分為對照組、6?OHDA組、Rg1+6?OHDA組及Rg1+LY294002+6?OHDA組。
　　1.3 MTT法檢測細胞生長
　　將傳代細胞接種于96孔板中，每孔細胞數量為3×103個。當細胞均勻貼壁生長時，在有或者無LY294002共存情況下，先用10-8mol/L的Rg1預保護細胞24 h，再用6?OHDA處理，24 h后去除培養液，加5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃、體積分數0.05的CO2培養箱繼續培養4 h，每孔中加DMSO 100 μL，混勻后用酶標儀檢測波長570 nm處的吸光度(A)值。計算細胞存活率。
　　1.4 免疫印跡法檢測pAkt和Akt蛋白的表達
　　將傳代細胞接種于6孔板中，6?OHDA組用6?OHDA(100 μmol/L)處理細胞0.5、1、2、4、6 h。Rg1預保護組先用10-8mol/L的Rg1預保護細胞24 h，再用6?OHDA處理細胞0.5、1、2、4、6 h，去掉培養液，收集細胞，2 000 r/min離心5 min，沉淀細胞。去掉上清液，用含蛋白酶抑制劑(2 mg/L aprotinin,2 mg/L leupeptin, 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluoride)和磷酸酶抑制劑(1 mmol/L sodium orthovanadate,10 mmol/L NaF)Nonidet P?40(20 mmol/L Tris?HCl, pH 7.5;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L CaCl2;1 mmol/L MgCl2; 體積分數0.10 的glycerol; 體積分數0.01的Nonidet P?40)溶液裂解細胞。應用Bradford試劑測定蛋白濃度，取20 μg的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，在100 g/L SDS?PAGE凝膠上電泳，然后轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。以體積分數0.05脫脂奶粉室溫封閉2 h后與抗pAkt(1∶1 000)或抗Akt(1∶2 000)一抗4 ℃孵育過夜，繼以羊抗兔IgG?HRP二抗孵育2 h，使用ECL化學發光試劑進行檢測，用pAkt/Akt的灰度比值代表Akt的磷酸化活性。
　　1.5 統計學分析
　　本文結果的數據以均數±標準差表示，應用Graph Pad Prism 5.0統計軟件進行單因素方差分析(One?Way ANOV)，以Tukey法進行兩兩比較。
　　2 結 果
　　2.1 人參皂苷Rg1對抗6?OHDA對MES23.5神經元損傷的作用
　　6?OHDA組細胞存活率為0.732±0.060，與對照組(1.000±0.075)相比，細胞存活率下降26.8%，差異有顯著性(F=25.12,q=7.604,P<0.01)。應用10-8mol/L Rg1預處理細胞24 h，可明顯對抗6?OHDA的毒性作用，細胞存活率為0.900±0.044，較6?OHDA組升高23.0%，差異有極顯著性(q=4.768，P<0.05)。MES23.5細胞經人參皂苷Rg1和LY294002預處理24 h后，再與6?OHDA共同作用24 h，結果顯示細胞的存活率為0.602±0.062，與6?OHDA組比較無顯著差異。說明PI3K特異性抑制劑LY294002可以完全阻斷Rg1對MES23.5細胞的保護作用。
　　2.2 6?OHDA對MES23.5細胞pAkt表達的影響及Rg1的保護作用
　　MES23.5細胞經100 μmol/L的6?OHDA處理0.5、1、2、4、6 h后，6?OHDA可以時間依賴性地降低pAkt的表達(F=24.51，P<0.01),Rg1+6?OHDA組pAkt表達明顯增強,在0.5 h差異有顯著性(t=471.60，P<0.01)。提示Rg1可通過增強PI3K/Akt信號通路的活性，對抗6?OHDA的毒性作用。見表1。表1 Rg1預處理對6?OHDA誘導的MES23.5細胞pAkt表達的影響
　　3 討 論
　　人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分，藥理學研究表明，Rg1具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增強記憶力等作用。近年來的研究顯示，人參皂苷Rg1具有神經營養和神經保護作用，Rg1能夠對抗MPTP對小鼠黑質紋狀體系統多巴胺神經元的損傷，其機制與抗凋亡和抗氧化應激有關。本研究室的前期工作已證實Rg1對神經毒素6?OHDA誘導的大鼠黑質紋狀體系統多巴胺能神經元的損傷具有明顯的保護作用[4]。體外細胞實驗亦證實，Rg1可以對抗6?OHDA對雜交瘤性多巴胺能神經元細胞系MES23.5細胞的損傷[5]。為了進一步探討人參皂苷Rg1神經保護作用的信號通路，本研究應用6?OHDA誘導MES23.5神經元細胞的損傷，觀察6?OHDA對細胞存活率及磷酸化Akt表達的影響及人參皂苷Rg1的保護作用。結果顯示，6?OHDA對MES23.5細胞具有明顯的毒性作用，可以降低細胞的存活率。6?OHDA可以時間依賴性地降低磷酸化Akt的表達，應用人參皂苷Rg1可以明顯對抗6?OHDA的毒性作用，提高pAkt的表達，應用PI3K特異性抑制劑LY294002進一步揭示Rg1的神經保護作用與PI3K/Akt信號通路的激活有關。

PI3K/Akt是胰島素樣生長因子Ⅰ受體(IGF?ⅠR)信號傳導通路中重要的信號分子，具有促進細胞增殖和分化、抑制細胞凋亡及促進骨架蛋白重排的作用[6,7]。PI3K被激活后，即可通過磷酸化激活其下游信號蛋白Akt，激活的Akt可以直接磷酸化多種轉錄因子，如Bcl?2和NF?B，從而促進細胞的存活[8,9]。6?OHDA作為一種神經毒素，可以直接抑制線粒體電子傳遞鏈復合物，導致ATP耗竭細胞變性死亡;也可通過單胺氧化酶B生成過氧化氫，再由Fe2+經Fenton反應生成羥自由基，造成DA能神經元變性、凋亡[10]。在前期實驗中，我們發現人參皂苷Rg1可刺激雌激素受體(ER)陽性的乳癌細胞MCF?7增生并可增強雌激素反應元件的活性，進一步的實驗揭示Rg1不直接與ER結合，但可以明顯增加MCF?7細胞內IGF?ⅠR的表達及IGF?ⅠR啟動子的活性，且此作用可以被IGF?ⅠR拮抗劑JB?1所阻斷[11]。上述結果表明，Rg1作用機制與IGF?ⅠR信號途徑有關。為了探討6?OHDA神經毒性作用及Rg1神經保護作用的信號通路，本研究觀察了6?OHDA對MES23.5細胞PI3K/Akt信號通路的影響，結果顯示應用6?OHDA處理細胞自4 h開始，Akt的活性較對照組明顯降低，提示6?OHDA通過抑制PI3K/Akt信號通路活性發揮其毒性作用。而人參皂苷Rg1預處理組pAkt表達較對照組明顯增加，提示Rg1可能通過增強PI3K/Akt信號通路的活性對抗6?OHDA的毒性作用。為進一步證實人參皂苷Rg1的神經保護作用與PI3K/Akt信號通路有關，本研究應用PI3K特異性抑制劑LY294002，觀察其對Rg1神經保護作用的影響，結果顯示，LY294002可以完全阻斷Rg1對MES23.5細胞的保護作用。
　　綜上所述，人參皂苷Rg1可明顯對抗6?OHDA對MES23.5細胞的毒性作用，其作用機制與PI3K/Akt信號通路的激活有關。
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