流式細胞術在臨床研究方面的應用

流式細胞術在臨床研究方面的應用

                                     作者：韓兆東 阮月芹 安新業 孔祥華 陳佳榮 周玉明

【關鍵詞】  細胞
　　【關鍵詞】  流式細胞儀；臨床應用；流式細胞術
    流式細胞術（flow cytometry,FCM）是利用流式細胞儀對細胞等生物粒子的理、化及生物特性進行分析的方法。流式細胞儀是近代細胞生物學、分子生物學、分子免疫學和單克隆技術、激光技術、電子計算機術等學科高度發展的綜合結晶。在免疫學、血液學、腫瘤學等學科及臨床研究方面得到廣泛應用［1］。
　　FC500是由美國貝克曼庫爾特（BECKMAN COULTER）公司2003年推出的臨床及科研型流式細胞儀系統。該儀器可同時測定前向散射光（FORWARD SCATTER）、側向散射光（SIDE SCATTER）及利用一個488 nm單束激光激發五個熒光染科所產生的熒光信號。因此，該儀器可對各個細胞進行相關的多參量的分析。
　　FCM的應用標志著細胞學、腫瘤學、免疫學等進入了細胞的分子水平的研究，隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經從科學研究走入了臨床應用階段，在我國臨床醫學領域里已有著廣泛的應用。
　　1  FCM在免疫學中的應用
　　FCM廣泛地應用于檢測各種免疫細胞的表面標志及細胞內各種細胞因子等，通過對病人淋巴細胞各亞群數量的測定來監控病人的免疫狀態，指導治療。有大量文獻介紹了淋巴細胞在各種疾病中的變化。正常人群T淋巴細胞CD4/CD8比值大約為2∶1，但在人體細胞免疫力低下時可出現比例下降甚至倒置。B細胞CD19與機體免疫球蛋白呈正相關。NK細胞反應機體對病毒感染的細胞和腫瘤細胞的殺傷能力及巨噬細胞的殺菌活性。FCM通過對人白細胞抗原（HLA）配型的測定可以為異體干細胞移植病人選擇出最合適的供體并進行骨髓或器官移植后免疫狀態的監測。外周血HLAB27的表達及其表達程度與強直性脊髓炎的發生有很大程度的相關性，運用HLAB27/HLAB7雙標記特異性單克隆抗體檢測抗原，可同時排除交叉反應，其敏感性較傳統的微量細胞毒實驗大大提高［2］。用FCM檢測陣發性睡眠性血紅蛋白尿患者血細胞細胞膜上的CD55、CD59已能從病理上提供直接的證據，比傳統的溶血試驗具有更高的特異性和靈敏度。用FCM檢測紅細胞、粒細胞抗體及血小板表面的相關抗體，對確診自身免疫性貧血、粒細胞減少癥及血小板減少性疾病，均具有檢測速度快、靈敏度高、特異性好的優點［2］。
　　2  FCM在血液學中的應用
　　白血病分型是MIC分型的重要組成部分，也是對FAB分型的補充；是對白血病診斷、選擇化療方案和判斷預后的重要依據；對白血病發病機制的研究也具有重要作用。由于白血病不同系列、不同分化階段血細胞膜表面及漿內表達不同的分化抗原，且與相應正常骨髓細胞的表達存在差異，故應用FCM能很好的對白血病進行免疫分型，并能夠提供正常細胞在演變成惡性腫瘤過程中細胞基因及抗原標志發生變化的信息，而這種變化常常是細微的，以至于常規FAB方法不能分辨。這使我們對血液腫瘤細胞的生物學特征有了更深入和更精確的認識。FCM還可用于血小板膜糖蛋白異常所致疾病的診斷，包括先天性或獲得性血小板的疾病，評價活化血小板程度在血栓疾病和血栓前狀態發生發展中的作用。用FCM通過對外周血網織血小板的測定，有助于血小板減少癥的病因學診斷。可作為骨髓移植、造血促進因子和骨髓移植后骨髓血小板造血恢復有用的監控指標。
　　應用FCM檢測某些免疫指標，能對再生障礙性貧血的發病機制進行研究。再障是一組由不同發病機制介導的骨髓造血功能障礙綜合征。其發病機制復雜，目前尚未完全明了，但越來越多的臨床和實驗室證據表明免疫介導的造血抑制，是再生障礙性貧血最常見的病理之一。而且，具有免疫表型異常（如CD4/CD8倒置、CD8+活化T細胞或TCRγ，δ等異常增高）的患者臨床表現相對嚴重，但免疫治療相對有較好的療效。微小殘留病灶（MRD）檢查：白血病病人在獲得血液學緩解后，體內還存在1010以下的白血病細胞。這樣少量的白血病細胞常規的顯微鏡不能檢出。在強化治療和維持治療后可逐步減少，但難以徹底清除，這是復發的根源。檢測MRD是決定進一步治療策略和選擇采集外周血造血干/祖細胞自體移植及異基因骨髓移植時機的依據。
　　多發性骨髓瘤（MM）：多發性骨髓瘤是漿細胞異常增生性疾病，正常漿細胞為CD38+/CD45 dim-，使用CD38/CD45雙標記檢測外周血和骨髓標本，可以準確劃定漿細胞群。通常使用CD38和CD45，結合輕鏈檢查，對多發性骨髓瘤細胞進行分析。另外，正常漿細胞的表面標記為CD19+/CD56-，而多發性骨髓瘤細胞通過為CD19-/CD56+。這樣，使用流式細胞儀對外周血或骨髓標本進行多參數分析，并計算漿細胞含量，對于多發性骨髓瘤的診斷和治療評估有重要意義。
　　CD34的絕對計數：造血干/祖細胞移植加強烈化療是治愈某些難治性疾病的有效方法；它不僅可以用于某些惡性血液病的治療，而且還可以用于其他惡性實體瘤的治療。骨髓移植（BMT）或外周血造血干細胞移植（PBSCT）的成功與否，除了與是否合并并發癥有關外，移植物中CD34+細胞的數量和質量是快速成功植活的重要因素。精確測定CD34對于判斷移植后的植活和選擇GCSF動員外周血干細胞的采集時間，有著重要指導意義。
　　3  FCM在腫瘤學中的應用
　流式細胞術利用實體瘤標本或穿刺標本、胸腹腔液體、膀胱沖洗液、尿液、食道鏡及支氣管鏡鉗取的少量活檢組織等對腫瘤細胞DNA會計師測定，解析細胞周期，通過腫瘤細胞異倍體測定，鑒別良性與惡性腫瘤，預測各種癌的預后，并能在化療中對藥物的選擇，放療中強度、時間的決定等起主要作用［5］。根據細胞周期分析結果，適當選用周期特異性藥物或非周期特異性藥物，可協助擬定治療方案；根據化療過程中腫瘤細胞DNA會計師分布直方圖的變化，可了解細胞動力學變化，以此評估藥物療效。
　　多藥耐藥（MDR）的研究：白血病治療及腫瘤化療的失敗在很大程度上是由于白血病細胞及腫瘤細胞對化療藥物產生了耐藥。因此，對白血病和腫瘤細胞耐藥機制的研究具有重要的意義。但耐藥的形成過程很多，主要有幾個方面，包括藥物吸收減少、細胞解毒作用增強、靶分子改變、DNA損傷修復能力增強、細胞內藥物溢出增多、細胞凋亡的抑制等。多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白，是白血病細胞及腫瘤細胞抗藥性的分子學基礎，也是影響化療療效的主要障礙。利用FCM檢測多藥耐藥基因，則可為藥理學研究提供依據。
　　參  考  文  獻
　　1左邊富流式細胞術與生物醫學［M］沈陽：遼寧科學技術出版社，1996129~422
　　2單衛民，馮萍，俞秋興流式細胞儀檢測HLAB27［J］臨床檢驗雜志，2000，18（6），366
　　3Jennnings CD,Foon KARecent advances in flow cytometry;application to the diagnosis of hematologic malignancy［Ｊ］Blood,1997,90(8);2863
　　4韓悅，王兆鉞，朱明清，等血小板血身抗體的流式細胞儀檢測與意義［J］臨床血液學雜志，2000，13（5）:222
　　5沈蘭蘭，蕭樹東流式細胞儀技術在消化道腫瘤中的應用［J］引進國外醫藥技術與設備，1999，5（2）: 19

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