胃腸舒對大鼠胃腸平滑肌細胞鈣離子濃度的影響
作者：宋曉冬 楊成 劉孟安 孫豐潤 劉穎 張麗霞 劉文波
【摘要】 目的 通過測定體外培養的SD大鼠胃腸平滑肌細胞內游離Ca2+濃度，觀察胃腸舒對SD大鼠胃腸平滑肌細胞內游離Ca2+濃度的影響，探討胃腸舒促胃腸動力的作用機制。方法 離體培養SD大鼠胃腸平滑肌細胞，應用特異性Ca2+熒光探針Fura-2AM負載細胞，激光共聚焦顯微鏡檢測游離Ca2+濃度。結果 胃腸舒在25、50、100 mg/ml 時均可升高胃腸平滑肌游離Ca2+濃度，且隨劑量增加而加強。結論 胃腸舒具有升高胃腸平滑肌細胞游離Ca2＋的作用，Ca2+作為細胞內第二信使可能參與了胃腸舒促進胃腸平滑肌細胞的動力機制。
【關鍵詞】 胃腸舒；胃腸平滑肌細胞；Ca2+濃度 ；Fura-2AM；激光共聚焦顯微鏡
【Abstract】 Objective To observe Weichangshu on free Ca2+ concentration in gastrointestinal smooth muscle cell and explore its mechanism through determining free ［Ca2+］i concentration in rat gastrointestinal smooth muscle cell.Methods SD rat gastrointestinal smooth muscle cells were cultured and loaded with Fura-2AM.［Ca2+］i was measured by fluorescent intensity in each group cell with laser scanning confocal microscope. Results 25, 50, 100 mg/ml Weichangshu could elevate ［Ca２＋］i in gastrointestinal smooth muscle. The level of ［Ca２＋］i acted in dose-dependent. Conclusion The data indicated Weichangshu could increase ［Ca２＋］i in gastrointestinal smooth muscle cells. Ca２＋ as an intracellular second messenger, might be involved in the mechanism by which Weichangshu promoted the motility of gastrointestinal smooth muscle cells.
【Key words】 Weichangshu,gastrointestinal smooth muscle cells,［Ca２＋］i,Fura-2AM,laser scanning confocal microscope
胃腸運動障礙型疾病是臨床多發病，多與胃腸蠕動功能減弱有關，是一類無法用解剖結構異常來解釋的臨床疾病，其主要病理生理基礎為胃排空延遲及小腸傳輸功能障礙［１,２］，現臨床最常用的促胃腸動力藥促進胃腸蠕動雖然有較好療效，但其副作用如藥理作用受限、催乳素增加、焦慮、激動、運動性不安、共濟失調、腹瀉、腹痛等不可忽視。目前胃腸運動障礙型疾病由于發病機制尚不清楚［3,4］，其藥物的研發受到限制，因此研究該類疾病的調控機制，為開發中藥新藥提供科學的數據非常重要［5］。
胃腸舒是本課題組研究人員根據《傷寒論》大承氣湯、小承氣湯、調胃承氣湯三方化裁，取大黃、枳殼、甘草組方，經臨床反復藥物篩選研制而成的純中藥制劑，可起到有效促進胃腸動力的作用［6,7］。本研究選取SD大鼠胃腸組織進行原代細胞培養，構建胃腸平滑肌細胞模型，不同濃度的胃腸舒作用后，測定用藥后胃腸平滑肌細胞內游離Ca2+濃度的變化，初步探討了胃腸舒促進胃腸動力的分子機制。
1 材料與方法
1.1 材料 胃腸舒由濱州醫學院附屬醫院制劑室提供；西沙必利由浙江京新藥業股份有限公司生產；標準SD大白鼠由煙臺綠葉實驗動物中心提供；DMEM培養基購自GiBco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司；Fura-2AM Ca2+熒光探針購自碧云天生物技術研究所；牛血清白蛋白購自碧云天生物技術研究所；HERA CO2培養箱；TCS SPE 激光掃描共聚焦顯微鏡。
1.2 方法
1.2.1 離體胃腸平滑肌細胞的培養：選擇標準SD大白鼠，體質量180～200 g，雌雄各半，乙醚麻醉，剖腹后迅速剪取胃體、空腸組織，PBS清洗后剪碎，去除上清液，重復清洗2～3次。將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液，加入0.25％胰蛋白酶，在4 ℃孵育6～18 h。移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37 ℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30 min。待小塊組織完全消化溶解后，過200目網，1 000 r/min離心7 min。棄上清液，向細胞沉淀中加入新鮮配制含20%胎牛血清的DMEM培養液，輕輕吹打，后按每瓶(25 ml)3×104活細胞接種在培養瓶里，放入37°C孵箱里靜置培養待測，CK×41倒置相差顯微鏡觀察拍照。
1.2.2 平滑肌細胞的鑒定：將處理好的蓋玻片，放入6孔板使之與孔底貼合緊密，進行細胞培養。細胞生長至第5代吸去培養液，先用PBS洗滌已貼壁蓋玻片2～3次。95%酒精室溫固定20 min，PBS洗2～3次。0.1% TritonX-100室溫孵育20～30 min增強細胞通透性。正常羊血清于37℃封閉20 min。滴加一抗兔抗鼠α-actin單克隆抗體（1∶200，購自Sigma公司）室溫過夜，滴加二抗羊抗兔FITC-IgG（1∶100），37 ℃孵育2 h，倒置熒光顯微鏡（波長500 nm）觀察拍照。
1.2.3 胞內鈣離子濃度測定：實驗分為5組，分別為空白對照組、西沙必利對照組（0.51 mg/ml）、胃腸舒小劑量組Ⅰ組（25 mg/ml）、胃腸舒中劑量組Ⅱ組（50 mg/ml）、胃腸舒大劑量組Ⅲ組（100 mg/ml）。D-Hanks液吹打6孔板中培養的胃腸平滑肌細胞，用移液槍吸取1 ml細胞懸液于1.5 ml離心管中進行Fura-2AM熒光探針的負載。胞內鈣離子測定方法參考文獻［7］方法，稍有改進。將細胞懸液常溫離心洗滌950 r/min×5 min×3次，棄上清液。避光加入50 μl濃度為10 μmol/L（使用濃度）的Fura-2AM，37℃避光孵育負載細胞40～50 min，輕輕搖動，以加速Fura-2AM進入細胞內，實驗過程中注意用鋁箔包嚴。950 r/min離心5 min終止孵育，棄上清液。在沉淀中加入D-Hanks液，離心洗滌950 r/min×5 min×3次，洗去胞外殘存的Fura-2AM，棄上清液。D-Hanks液吹打為細胞懸液進行激光掃描共聚焦顯微鏡檢測。檢測之前，吸取少量細胞懸液，滴片，加蓋蓋玻片。激光共聚焦顯微鏡下立即掃描檢測（激發波長為340 nm，發射波長為510 nm）。
1.3 統計學處理 數據以x±s表示，胃腸舒各濃度組與空白對照組及西沙必利對照組間比較用方差分析，各組間兩兩比較。
2 結果
2.1 胃腸平滑肌細胞的原代培養及其鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見細胞形狀橢圓形，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯呈“峰谷”狀，峰處為多層細胞，谷處為單層或雙層細胞，培養4 d后細胞鋪滿培養瓶瓶底。為確定胃腸平滑肌細胞離體分離培養成功，用兔抗鼠а-actin mAb單克隆抗體進行了鑒定，細胞經漂洗后置于熒光顯微鏡下觀察，負載了FITC的細胞經500 nm的波長激發下產生熒光，可見95% 以上的細胞顯示了陽性熒光標記，說明離體培養的平滑肌細胞成功。
圖1 胃腸平滑肌細胞的鑒定×400
2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測胃腸舒對胃腸平滑肌細胞內Ca2+的影響
2.2.1 各組胃腸平滑肌細胞內Ca2+熒光強度值比較：測定各藥物組選定細胞的熒光強度值，計算均數±標準差（x±s），即為該藥物濃度細胞的平均熒光強度。對胃腸平滑肌細胞各藥物組中細胞內Ca2+熒光強度兩兩比較：胃腸舒片各濃度組與空白對照組相比，均存在極顯著差異(P＜0.01)，即胃腸舒片能明顯升高胃腸平滑肌細胞內Ca2+濃度（表1）。胃腸舒片各濃度組與西沙必利對照組比較：胃腸舒25 mg/ml組與西沙必利0.51 mg/ml組差異不顯著(P＞0.05)，即兩者在升高平滑肌胞內Ca2+濃度方面效果相當。胃腸舒片50 mg/ml組與西沙必利0.51 mg/ml組差異顯著(P＜0.05)，即胃腸舒片50 mg/ml組在升高平滑肌胞內Ca2+濃度方面，效果優于西沙必利0.51 mg/ml組。胃腸舒100 mg/ml組與西沙必利0.51 mg/ml組相比，存在極顯著差異(P＜0.01)，胃腸舒100 mg/ml組在升高平滑肌胞內Ca2+濃度方面效果明顯優于西沙必利0.51 mg/ml組（表1）。表1 胃腸舒組與對照組細胞熒光強度值比較與空白對照組比較*P＜0.01, 與西沙必利組比較△P＜0.05
2.2.2 激光共聚焦顯微鏡拍攝各組胃腸平滑肌細胞內Ca2+熒光強度圖：圖2是在激光共聚焦顯微鏡下觀察到的胃腸舒對胃腸平滑肌細胞的影響，圖中照片明顯顯示胃腸舒組胃腸平滑肌細胞的Ca2+流高于空白對照組和西沙必利組，且隨著胃腸舒用藥濃度的增加對Ca2+流的影響越大。
3 討論
胃腸動力障礙疾病是常見的消化系統疾病之一，在世界范圍內發病率較高，且有日漸上升趨勢。目前認為，胃腸動力障礙性疾病的發生可能不僅與中樞神經系統、自主神經系統有關，還可能與離子濃度、離子通道等有關，因此，對該病發病機制中離子濃度和離子通道的變化研究十分重要。
目前已知離子通道的信號傳遞是細胞外信號調控胃腸道平滑肌細胞活動的一個重要途徑， 有賴于Ca2+、Na+、K+、Cl-等多種離子的存在［8～14］， 其中 Ca2+是胃腸平滑肌的興奮-收縮耦聯者，當胞質內 Ca2+ 濃度至一定水平時，即使沒有膜電位變化，也可觸發胃腸平滑肌收縮。L 型 Ca2+通道是 Ca2+進入胃腸細胞的主要通道， 應用調控離子通道類藥物將是今后治療胃腸動力類藥的新方向。胃腸道神經系統中最主要的興奮性神經遞質是乙酰膽堿（ACh），可以與毒蕈堿的 M2 型受體結合。副交感神經節后纖維釋放 Ach 作用于平滑肌 M受體后可開放質膜上 L型 Ca2+通道, 產生內流致肌收縮［15～18］。
胃腸平滑肌細胞胞漿游離Ca2+在平滑肌細胞收縮與舒張過程中起重要的“第二信使”作用。一般認為，平滑肌收縮和舒張活動與胞內鈣離子濃度變化密切相關：高濃度Ca2+引起平滑肌收縮,低濃度Ca2+引起平滑肌舒張。應用Ca2+敏感的熒光探針Quin-2、Fura-2、Indo-l 及Fluo-3 測定顯示平滑肌細胞靜息時胞內Ca2+ 濃度為120～270 nmol/ L ，激活時可達500～700 nmol/ L。肌細胞膜系統在維持細胞內外Ca2+ 正常濃度中起重要作用,通過質膜和肌質網膜的移動調節胞內Ca2+濃度。平滑肌收縮時的鈣離子來源于細胞外Ca2+內流或細胞內鈣庫Ca2+釋放(主要是肌質網)。生理條件下,胞外Ca2+可通過質膜鈣離子通道進入細胞；肌質網貯存Ca2+，也可通過IP相關通道或通過Ca2+誘發的Ca2+釋放進入胞漿。平滑肌細胞外Ca2+內流和細胞內貯存Ca2+釋放相互影響,細胞外Ca2+通過L 型鈣離子通道內流可誘發鈣離子誘導的鈣離子釋放(CICR)，相反，細胞內貯存Ca2+減少亦可引發細胞外Ca2+進入細胞(CRAC)。CRAC 多通過非選擇性離子通道，且不被 L型鈣離子通道拮抗劑拮抗［19，20］。
本實驗通過選取SD大鼠胃腸平滑肌細胞的原代培養，不同濃度藥物作用后，熒光探針Fura-2AM標記培養大鼠胃平滑肌細胞內的游離Ca2+ ，通過激光共聚焦顯微鏡檢測到了胃腸平滑肌細胞熒光強度值：胃腸舒片100 mg/ml組：胃134.543±15.328、腸157.173±18.270；胃腸舒片50 mg/ml組：胃 68.585±6.299、腸 89.703±24.945；胃腸舒片25 mg/ml組：胃 51.125±20.358、腸58.455±8.781；西沙必利0.51 mg/ml：胃 48.963±7.871、腸 49.825±14.063；空白對照組：胃18.350±6.528、腸 28.150±4.213，從熒光強度值顯示胃腸舒組與空白對照組相比，能明顯提高胃腸平滑肌細胞內Ca2+ 的濃度，并且效果優于西沙必利組，推測Ca2+濃度的增高可能參與了胃腸舒促胃腸動力的作用。
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