醫藥類畢業論文

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　　研究顯示，生長激素對人體免疫系統發育及調節具有重要作用,生長激素可增強機體的細胞免疫功能,促使NK細胞活性增強，使白細胞介素2(IL?2)和干擾素(IFN?γ)表達增強[1]。NK細胞是Th1類細胞，IL?2和IFN?γ是Th1類細胞因子，因此推測重組人生長激素可能促使機體免疫狀態向Th1狀態偏移。本研究以IL?2和IFN?γ代表Th1類細胞因子，白細胞介素4(IL?4)和白細胞介素10(IL?10)代表Th2類細胞因子，通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT?PCR)技術檢測原發性肝癌術后短期應用重組人生長激素后外周血單個核細胞(PBMC)Th1/Th2細胞因子的表達，探討短期應用重組人生長激素在肝癌切除后對機體Th1/Th2偏移的影響，現將結果報告如下。

　　1、 資料和方法

　　1.1 一般資料

　　原發性肝癌病人36例，分為重組人生長激素組和單純手術切除組。重組人生長激素組16例，男14例，女2例;年齡38～66歲，平均52.5歲;肝細胞性肝癌10例，膽管細胞性肝癌3例，混合細胞性肝癌3例;腫瘤直徑4.4～8.2 cm; HBcAb(+)10例，HBsAg(+)10例，HBsAb(+)4例，HBeAg(+)1例，HBeAb(+)4例。單純手術切除組20例，男16例，女4例;年齡39～61歲，平均49.8歲;肝細胞性肝癌18例，膽管細胞性肝癌2例;腫瘤直徑3.3～10.3 cm;HBsAg(+)18例，HBsAb(+)2例，HBeAg(+)2例，HBeAb(+)10例，HBcAb(+)18例。

　　1.2 標本來源

　　所有病人均于術前和術后10 d采集肘靜脈血4 mL,EDTAK2抗凝。

　　1.3 PBMC的提取

　　用淋巴細胞分離液離心分層法分離提取病人血標本中的PBMC。

　　1.4 PBMC總RNA的提取

　　異硫氰酸胍法提取PBMC中的總RNA。

　　1.5 聚合酶鏈反應(PCR)引物

　　4種細胞因子和β?actin的引物序列見表1。均由上海博亞生物工程公司合成。

　　1.6 逆轉錄反應

　　M?MLV逆轉錄酶購自美國GB?CO公司。 5～10 μg總RNA加入5×buffer 4 μL，0.1 mol/L DDT 2 μL, M?MLV 1 μL(200U), 4×dNTP(10 mmol/L,每種)1 μL，下游引物P2 (50 pmol/L)0.5 μL,總反應體積20 μL。37 ℃作用1 h后，95 ℃ 10 min滅活M?MLV。

　　1.7 PCR反應

　　在20 μL的RT反應產物中，加入10×buffer10 μL，25 mmol/L氯化鎂8 μL， 4×dNTP 1 μL，上游引物P1(50 pmol/L)0.5 μL，液體石蠟100 μL，95 ℃下5 min，然后加入TaqDNA聚合酶(106 U/L)2 μL。循環條件：94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，35個循環;最后72 ℃延長7 min。

　　1.8 PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳及其圖像分析

　　PCR產物在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳20～30 min。紫外線燈下觀察并拍照。用美國Kodak凝膠分析系統檢測其吸光度(A)值作為表達強度，以β?actin為內參照。表達強度=細胞因子A值/β?actin A值。

　　1.9 Th1/Th2平衡狀況的判斷

　　如果僅IFN?γ 和(或) IL?2表達，或者其表達強度比IL?10 和(或) IL?4的表達強度高，則為Th1狀態;如果僅IL?10 和(或) IL?4表達，或者其表達強度比IFN?γ 和(或) IL?2的表達強度高，則為Th2狀態。如果4種細胞因子均未表達或表達強度一致或類似，則為Th0狀態。

　　1.10 統計學處理

　　采用PPMS 1.5 統計軟件[2]進行統計處理。

　　2、 結果

　　重組人生長激素組病人與單純手術切除組術前Th1、Th2表達差異均無顯著性(P>0.05)。兩組術后第10天比較，差異有顯著性(Uc=2.58，P<0.01)。見表2。

　　表2 兩組不同時間Th1、Th2狀況比較(例)組 別標本采取時間nTh1Th2Th0單純手術切除組術前201424術后10 d20947重組人生長激素組術前161024術后10 d161411

　　3、 討論

　　生長激素對兒童免疫功能有重要的調節作用。陳耀勇等以NK細胞、IL?1α和IL?2活性等指標，對去垂體大鼠及生長激素缺乏癥(GHD)病兒在生長激素治療前后的免疫指標進行了研究，發現去垂體大鼠NK細胞活性及IL?1α和IL?2活性均明顯降低，外源性生長激素可使上述指標得到不同程度的恢復。GHD病兒NK細胞活性明顯降低，經生長激素治療3個月后恢復到正常水平， IL?1α和IL?2活性治療后有逐漸增高的趨勢。國內楊毅等研究則顯示，兒童胸腺、 淋巴結和外周血淋巴細胞都有生長激素合成細胞，認為生長激素對于影響和調節小兒免疫系統發育具有重要作用。 生長激素對成年人免疫系統的調節也具有重要作用。正常人的胸腺和淋巴細胞上存在生長激素的結合位點，生長激素與之結合后可促進淋巴組織增生。研究顯示，生長激素能影響T細胞的功能，并促使T細胞在胸腺中發育[3]。無論外源性或內源性生長激素均可使PHA激活的淋巴細胞IL?2R、 IL?2和IFN?γ的表達增強，抗生長激素抗體可抵消這一作用，說明生長激素對淋巴細胞的功能具有重要的調節作用[4]。重組人生長激素可使危重病病人NK細胞活性增強，并提高CD4/CD8比率。由以上研究報道可以看出，重組人生長激素可增強機體的細胞免疫功能，NK細胞是Th1類細胞，IL?2和IFN?γ是Th1類細胞因子，因此，重組人生長激素可能促使機體向Th1狀態偏移。

　　以前的研究都未明確生長激素抗腫瘤作用的機制。自輔助性T細胞Th1/Th2亞群概念提出以來，人們對其在機體免疫反應中的作用進行了大量的研究。正常機體的Th1/Th2類細胞因子處于動態平衡，當這個平衡失衡并向Th1狀態或Th2狀態轉化時，稱為Th1/Th2的偏移。病理狀態下，如外傷、手術、感染和腫瘤等，均存在向Th2狀態的偏移， Th2類細胞因子優勢狀態不利于創傷恢復和抗腫瘤免疫。細胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要方式。IFN?γ、 IL?2和TNF?β等細胞因子在機體的抗腫瘤免疫中發揮重要作用，IL?2可刺激NK細胞和CTL細胞的殺瘤活性，而IFN?γ有較強的抗腫瘤和免疫調節作用，TNF?β可直接造成腫瘤細胞凋亡。以上細胞因子由Th1類細胞直接分泌，因此機體要處于良好的抗腫瘤狀態，Th1類細胞應占優勢。本實驗結果表明，術后重組人生長激素組比單純手術切除組Th1類細胞因子表達明顯增高，差異有顯著性。這說明肝癌病人腫瘤切除后重組人生長激素應用后可促使Th1類細胞因子表達，使Th1/Th2偏向Th1狀態，有利于腫瘤的治療。

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