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單分子光鑷技術對生命科學的應用論文
眾所周知，大多數宏觀的生物過程是由最基本的單個蛋白酶與單個DNA分子或RNA分子之間的反應來完成的。伴隨著生物技術和分子生物學的進步，生命研究日益向微觀層次深入并進入后基因時代，人們不再滿足于過去只對生物體中大量分子平均行為的研究，更傾向于從單分子水平解讀生物大分子的動力學細節。利用單分子技術研究生物學問題，尤其是針對蛋白質復合物相互作用的動態過程分析是近年國際上新興的研究方向。目前，單分子技術主要分為兩大類。一類基于熒光體系的單分子技術，主要包括單分子熒光共振能量轉移技術（singlemoleculefluorescencereso—nanceenergytransfer，smFRET）[1]、熒光相關譜技術（fluorescencecorrelationspectroscopy，FCS）[2]和隨機光學重建顯微鏡技術（stochasticopticalreconstruc—tionmicroscopy，STORM）[3]等。以STORM為例，它采用光轉換熒光探針（photo—switchablefluorescentprobes），可以在時間尺度上分離相互重疊發光的熒光分子，從而得到10~20nm高分辨率的三位重構圖像[3—5]。而傳統的光學顯微鏡技術由于受衍射極限的限制，分辨率都在幾百個納米的水平。STORM技術還可以在納米層次上揭示細胞內分子間相互作用及組織內細胞間的相互作用。相信隨著STORM技術的進一步發展，這一技術將被廣泛應用到DNA、蛋白質分子以及大分子復合體的研究[6]。另一類單分子技術則基于力學測量體系建立，主要以原子力顯微鏡（atomicforcemicroscope，AFM）、磁鑷及光鑷技術為代表[7]。如圖1所示，這三種技術分別利用機械臂、磁學和光學的方法來對研究對象施加作用力[7]。因此，它們所能達到的分辨率不同（表1[8]），其中以光鑷技術為最高，其空間和時間分辨率分別可以達到0。2nm（小于1個DNA堿基對的長度）和次毫秒級，同時，光鑷是通過激光實現對研究對象的非接觸捕獲的，力均勻地施加在整個研究對象表面，不會像AFM一樣對研究對象造成機械損傷。由于光鑷技術超高的分辨率，應用光鑷可以直接連續追蹤單個生物大分子折疊和去折疊的完整過程，實時測量力、距離、時間及中間態等動力學信息[8]，極大地滿足了人們從分子結構角度剖析生物分子工作機制的需求。
近三十年來，單分子光鑷技術逐漸趨于成熟，物理學家通過改進光學硬件配置，發展新的實驗方法（差分探測法[9]）等，由單光鑷、雙光鑷[10]到多光鑷，由線性光鑷、旋轉光鑷、全息光鑷[11]到納米光鑷[12—13]，大大提高了光鑷的測量精度和廣度，這也預示著光鑷技術具有不可估量的發展前景和廣闊的應用領域。本文將首先介紹單分子光鑷技術的基本原理和裝置，并結合實驗室的研究方向，介紹有關光鑷的基本實驗設計、光鑷在生命科學領域的應用，最后對光鑷的發展前景進行展望。
1光鑷基本原理
光是一種電磁波，在與物質相互作用時不僅會發生能量的傳遞，也會發生動量的傳遞，也就是說光會對該物質施加一定的力，即產生光的力學效應。1970年，A。Ashkin首次提出光輻射壓力（光壓）可以操縱微小微粒[14]。1986年，A。Ashkin和Chu等實驗發現，只需要一束高度聚集的激光，就可形成穩定的三維光學勢阱以穩定俘獲微粒[15]，由于只使用了一束激光，所以稱之為單光束梯度力光阱，簡稱光鑷。光鑷是基于光的輻射力建立的。如圖2所示，在折射率為n2的介質中存在一個折射率為n1的微粒（n1>n2），當一束帶有動量P1的激光穿過該微粒時，經兩次折射后，激光的動量變為P2。根據動量守恒定律，微粒將產生與激光的動量變化大小相等、方向相反的動量，即Δp。由動量與沖量的關系和牛頓第二定律可知，微粒會受到一等于動量變化率的作用力，因此，當我們采用高數值孔徑（NA>1）[15]的物鏡將激光聚焦到一個焦點f（捕獲中心）時，不論微粒上、下、左、右、前、后偏離激光焦點f，微粒都會受到一個指向焦點的作用力。這個焦點就如同一個“陷阱”可以捕獲該微粒，因此在光鑷實驗中，我們通過調節激光的位置就可以像一把無形的“鑷子”達到操控微粒的目的。同時，微粒偏離捕獲中心的距離和其受到的回復力成正比[16]，這決定了光鑷對微粒的操控不是剛性的，而是類似于“彈簧”，并符合胡克定律F=–kΔx。其中，F是拉力，k是光鑷的剛度系數（stiffness），Δx是微粒偏離激光中心的位移。通過微粒產生位移和激光的剛度系數即可計算出拉力F。因此，在操作過程中，我們可以通過實時測量微粒的位移得到微粒間的相互作用力，從而得到與微粒相連的生物分子上所受的作用力。
2光鑷實驗設計
光鑷技術的實驗環境一般為接近于生理環境的水溶液，可減少對樣品的損傷，同時實現在生物分子具有生理活性的條件下實時監測分子動態行為的目的。此外，如何對樣品進行處理是光鑷實驗設計中的另一個關鍵問題。由于生物分子，例如DNA、蛋白質等，往往在幾納米到幾十納米之間，光鑷的剛度一般不能穩定地捕獲和操控生物分子，因此需要借助一個表面修飾的微米量級的小球（微球）作為“手柄”，將生物樣品通過化學偶聯黏附在微球上，通過直接操控微球達到間接操控生物分子的目的[17]。生物大分子尤其是蛋白分子，通常尺寸較小，因此會在生物分子的一端或兩端通過化學方法交聯上一段或兩段DNAHandle[18]，使得生物分子兩側的微球間有足夠的空間距離，方便對單個生物分子進行力的測量并且減少微球間不必要的相互作用；選用的DNAHandle分子長度一般大于500bp[8]。圖2是雙光鑷技術研究生物樣品的經典單分子實驗體系[19]示意圖（以DNAHairpin為例），兩個聚苯乙烯小球表面分別免疫修飾了Streptavidin和anti—Digoxigenin，DNAHairpin一端被標記biotin與Streptavidin修飾的微球相連，另一端則通過巰基與DNAHandle共價交聯；DNAHandle則通過Digoxigenin與修飾anti—Digoxi—genin的微球相連。因此，當我們利用兩束激光分別捕獲兩個微球時，就可以對微球間的conjugates進行操作，通過移動光阱的位置，微球間的距離和力都會發生改變，我們通過測量這些數據就可以得到相關的動力學信息。
3光鑷技術在生命科學中的應用
近年來，基于光鑷技術的應用研究，證實了該技術獨到的應用價值。光鑷的應用基本分為四類，即光鑷與細胞生物學、光鑷與單分子生物學、光鑷與軟物質膠體科學和光鑷與物理學四個領域。在這些領域中，科學家們利用光鑷技術解決了許多重要的科學問題。結合我們實驗室的研究方向，我們將主要對光鑷在單分子生物學的應用加以介紹。光鑷亞納米級的空間分辨率和飛牛頓的力分辨率使其在研究一些生物大分子（如DNA/RNA雙鏈特性[20—22]、分子馬達的分子機制和生物學功能[17，23—24]、蛋白質折疊[25—27]以及染色質重塑[28]等）的動態運動細節（中間態、能量、折疊速率、作用力、距離等）方面成為一項不可或缺的單分子技術，并展示出巨大的發展前景。以下我們將對一些代表性的研究成果進行簡要介紹。
3。1研究DNA力學性質
現代生物學中一個最基本的生物學定律就是中心法則：即遺傳信息可由DNA流向DNA，完成DNA的自我復制過程；也可由DNA流向RNA再進一步流向蛋白質，完成轉錄翻譯過程。這是構成現代生物學的理論基石，因此，DNA、RNA與蛋白質的特性以及它們之間的相互作用無疑是整個生物學研究的核心。Bustamante等[29]首先利用單分子磁鑷技術操縱長約16μm的dsDNA分子，測量了DNA的拉伸特性：在0。1~10pN范圍內，DNA的拉伸行為符合蠕蟲鏈模型（worm—likechain，WLC），持久長度為50nm；而當力增加到65pN時，DNA的結構由B型變成S型[30—31]；人們用同樣的方法研究了ssDNA的力學性質，發現與dsDNA的拉伸曲線截然不同，ssDNA的持久長度僅有1nm�；谶@些實驗結論，科學家們就可以通過研究蛋白質對DNA拉伸特性的改變來研究DNA相關蛋白（如RNA聚合酶、核糖體、DNA異位酶等）的工作機制。細胞分裂時，DNA會發生凝縮形成高度聚集結構以維持遺傳信息的穩定性。之前人們對DNA如何形成核小體結構已經有了一定的認識，但是對更高級的染色體結構形成缺乏了解。Case等[32]利用光鑷技術將參與高級染色體結構形成的凝聚蛋白MuK—BEF作為研究對象解析了這一動態凝聚過程。Case等發現，與nakedDNA的力–延伸曲線（force—extensioncurve，FEC）相比，MuKBEF—DNA復合體表現出更大變化率的力–延伸曲線（FEC），并且當拉力達到17pN時，MuKBEF—DNA復合體會經歷一個鋸齒狀振蕩的平坦曲線，說明MuKBEF—DNA復合體經歷了個別凝聚事件（MuKBEF結合到DNA上時利用“夾子”這種張合的方式來凝聚DNA）。而當力被撤回時，MuKBEF—DNA復合體重新回到原始的凝聚態，Case等根據這一現象提出了MuKBEF復合物凝縮DNA的“夾子”模型，這一研究為DNA凝縮機制的研究提供了重要的科學依據。
3。2研究分子馬達的運動機制
生物機體的一切活動，從DNA的復制和轉錄、細胞分裂、肌肉收縮到細胞內物質轉運，最終都歸結為分子馬達做功的結果。分子馬達通過運動可以快速高效地將化學能轉化為動能，執行各種生物功能，因此，分子馬達的動力學機制成為研究者們關注的焦點。科學家利用光鑷觀察了分子馬達運動過程，發現分子馬達是以步進形式運動的，并測量了蛋白的運動步長，證明了單個驅動分子的力和運動速度與ATP濃度相關[17，23，33—34]。這些研究使得光鑷成為研究單酶動力學的重要手段，促使科學家利用光鑷技術研究表觀遺傳調控機制，尤其是ATP依賴的染色體重塑復合物的運動機制[35]�；蚪MDNA通常以染色質的形式存在于細胞中，以維持遺傳信息的穩定性。然而很多細胞生命活動（比如基因轉錄、DNA復制、DNA修復、DNA重組等）的正常進行都需要不同的DNA結合蛋白或者反式作用因子結合到特定的DNA區域（如啟動子、增強子等順式作用元件），進而發揮功能，因此需要染色質重塑蛋白復合物移動、驅逐和重組核小體使得染色質DNA從核小體上暴露出來。目前，光鑷研究染色體重塑復合物的工作已經取得了一定的進展。Bustamante實驗室利用光鑷成功操作單個核小體并研究核小體動態行為，發現在2~3pN的力作用下，核小體上外圍DNA與組蛋白八聚體的相互作用會被打破，而內部DNA與組蛋白的相互作用被打破則需要20pN以上的力[36]。Zhang等[37]則利用光鑷在核小體水平實時監測了RSC復合物的作用，測定了RSC轉移速率等動力學參數，證實了RSC是依賴核小體的轉移酶。Hall等[38]發現，核小體中DNA—組蛋白相互作用并不是均勻的，在空間上存在約5bp的周期，有3個強的作用區域，其中dyad區域的作用最強，另兩個較強的作用區域在離dyad約±40bp處，而核小體的進出端的相互作用較弱，這些強弱不同的相互作用形成了不同的能壘。這些能壘可能對染色體重塑復合物有著重要的影響，因為染色體重塑時可能需要克服核小體上的能壘，這些參數為以后染色體重塑復合物具體工作機制的研究提供了很好的參考。
3。3研究蛋白質折疊的動力學機制
光鑷在單分子生物學的另一個重要應用就是研究蛋白質折疊的動力學過程。在蛋白質折疊研究中，人們往往最關心的問題就是一維的氨基酸序列以何種方式折疊而變成穩定的有功能的三維結構的。眾所周知，蛋白質的折疊態、去折疊態及錯誤折疊態在生物體系中都同時存在。這些態與態之間的相互轉換和生物體系的功能直接相關，同時也和疾病的形成有著密切的關系[8]。盡管人們已經利用各種傳統的生物化學方法對蛋白質反折疊過程進行了幾十年的深入研究，但對蛋白質折疊過程中的具體動力學細節仍知之甚少。光鑷技術可以對操控單個蛋白分子并實施觀測整個折疊和去折疊的動力學過程，因此被越來越多地應用到研究生物物理的精細過程研究。最近，Gao等[26]利用雙光鑷技術對突觸SNARE蛋白的組裝機制進行了深入研究。在神經細胞分泌過程中，SNARE蛋白介導突觸小泡與突觸前膜的融合。SNARE蛋白包括定位在靶細胞膜上的t—SNARE（syntaxin和SNAP—25）和囊泡膜上的v—SNARE，只有當t—SNARE和v—SNARE通過組裝形成“拉鏈式”復合物時才能驅動膜融合。盡管過去的二十年已經做了大量研究，但是“拉鏈式”假說、裝配中間體、動力學和能量仍然不明。Gao等通過實時觀測單個SNARE復合體的組裝/去組裝過程，發現了SNARE復合體的“拉鏈式”結構和關鍵的“半拉鏈式”裝配中間體（t—SNARE和v—SNARE部分折疊到“離子層”），提出了一種效率高的“拉鏈式”組裝模型，即：SNARE復合體N末端的“拉鏈式”組裝是緩慢的，從而SNARE裝配中間體可以充當調節蛋白（如Munc18和Complexin）的結合平臺，然后在調節模式下，進一步穩定地裝配中間體快速及強有力地進行“拉鏈式”組裝直到C末端，最終在跨膜區驅動膜融合。此外，Zhang實驗室還研究了SNARE突變體、Munc18和Complexin對SNARE組裝/去組裝動力學過程的影響[39]。該研究成果從分子水平上加深了人們對神經分泌過程中SNARE蛋白復合體驅動融合機制的深入了解，同時為我們探索更多疾病相關性蛋白的動力學機制提供了很好的模式基礎，相信我們可以通過光鑷技術從生物物理層面解釋某些蛋白與疾病形成的關聯，為開發抗癌藥物提供更精確的結構水平的信息。
4光鑷與其他技術相結合
以上關于光鑷技術應用在生命科學領域的研究僅僅是冰山一角，但已經向我們展示了光鑷在單分子水平研究生物大分子動力學的優越性，它的應用極大地推動了生命科學尤其是生物物理學的發展，加速了人們從單分子水平解析DNA、蛋白質以及各種酶反應的動力學過程。然而每項實驗技術都有其一定的局限性，這就需要相關技術手段結合，克服彼此的劣勢，達到最理想的功效。光鑷也常常與其他光學技術相結合，成為性能更優越的技術手段。
4。1光鑷與smFRET技術結合
生物大分子尤其是蛋白質往往是三維結構，但目前光鑷僅能在一維空間研究它們結構動力學（沿光阱移動方向），存在一定的局限性。例如，馬達蛋白沿底物移動時會經歷復雜的分子內構象改變，超高分辨率光鑷僅能研究馬達蛋白沿底物移動的步長等動力學信息，而無法獲知蛋白的具體構象變化過程。smFRET技術即單分子熒光共振能量轉移檢測技術，則可通過給生物分子的不同結構域，或者相互作用的分子，比如受體與配體上分別標記donor和acceptor的染料分子，實時地觀測分子構象的變化過程，但其空間分辨率不高。因此，為實現在亞納米級的空間尺度上研究生物分子構象變化的目的，科學家們采用交錯分時的方法（interlacingandtimesharingmethod）將smFRET與光鑷技術相結合，并利用ssDNA與其互補序列的雜交過程證明了該方法的可行性[40]。相信隨著這種整合儀器設備的進一步完善，科學工作者將會通過熒光信號和成像技術在單分子、亞納米級空間尺度上多角度監測生物分子的構象改變，尤其是一些蛋白復合物和大分子機器，得到更多的動力學信息。
4。2光鑷與拉曼光譜結合
當一束單色光通過振動的分子時會發生非彈性散射，入射光的能量變化與分子內部分子鍵（molecularbond）的振動能量相一致，收集分子對入射光的拉曼散射光譜，就可以判斷分子的生物化學組成[41]。傳統共聚焦顯微拉曼光譜的后向散射橫切面很小，散射強度十分微弱，因此所得到的拉曼信號很弱，同時拉曼光譜探測技術通常使用化學修飾將研究對象固定在機制上，這種配置非常不利于生物分子維持其天然的生理狀態，也不利于背景噪聲的去除。而結合光鑷技術的激光光鑷拉曼光譜系統（lasertweezersRamanspectroscopy，LTRS）則可以利用激光形成的光阱捕獲生物分子，實現在溶液中將其固定并同時得到光譜信號的目的，保證了生物分子天然的微環境，大大提升了光譜的信噪比[41]。近年來，激光光鑷拉曼光譜系統已廣泛應用于不同細胞類型的分選[42]、細菌孢子[43]、囊泡等研究。不同于熒光技術，拉曼光譜的非彈性散射使其避開了光學漂白，可以實現實時、連續監測單細胞的動態過程。Moritz等[44—45]利用激光光鑷拉曼光譜控制單個大腸桿菌細胞，研究其對抗菌藥物的敏感性。首先在無藥狀態下測定大腸桿菌在生長周期的不同階段與DNA、RNA及蛋白質相關的不同拉曼振動譜帶，然后在加藥（盤尼西林/鏈霉素、頭孢唑林）狀態下測定729cm–1、1245cm–1和1660cm–1的光譜譜帶并與無藥狀態下的拉曼光譜相比較，發現大腸桿菌對頭孢唑林更加敏感。激光光鑷拉曼技術無需樣品預處理，對樣品無損害，是臨床研究一個很好的切入點，相信隨著該技術的進一步發展，其在細胞分選、癌細胞檢測及細胞動力學單細胞水平研究上會越來越有發展空間。
5發展前景及展望
由于光鑷技術集電子、光學、計算機編程、微觀操作和生物學為一體，國際上僅少數實驗室搭建了不同形式、可操作性強的光鑷裝置，但隨著光鑷應用日趨廣泛，光鑷的潛在發展趨勢也越發引人關注，更多的科研人員投身于光鑷技術的理論研究和應用研發，相信在不久的將來，隨著光鑷技術日趨成熟以及與其他光學技術結合，如熒光技術、拉曼光譜、全息技術、納米孔等，光鑷這項富有活力的新興技術將會在實時連續監測單細胞/單分子的生物動力學，細胞與細胞、分子與分子間的相互作用等生命科學領域做出更多貢獻。
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