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黃連生物堿成分的HPLC DAD MS 解析論文
黃連為毛茛科植物黃連( Coptis chinensis Franch) 、三角葉黃連( Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao) 或云連( Coptis teeta Wall) 的干燥根莖黃連中的主要活性成分原小檗堿類生物堿為季銨類生物堿。采用RP - HPLC 測定黃連中生物堿類成分含量時，小檗堿類在C18為填料的色譜柱上保留行為較差，通常需在流動相中加入離子對試劑改善保留行為，常用的離子對試劑為十二烷基硫酸鈉( SDS)，SDS 有分子量大、難揮發不適用于LC - MS 分析、易析出堵塞管路等缺點，有文獻在用三乙胺調節流動相pH 值后LC -MS 法分析黃連中生物堿，但三乙胺進入質譜系統后殘留時間較長，很難清除。本實驗用分子量小、溶解性好、易揮發、質譜中易清除的乙酸銨做HPLC 流動相中的離子對試劑，建立了同時測定黃連中3 個主要生物堿類成分的方法。測定了5 批黃連藥材的含量，并采用HPLC - ESI - MS 聯用方法鑒定了黃連中的主要生物堿類成分。以期為黃連及含黃連制劑質量控制提供參考。
1 材料與儀器
1. 1 試藥鹽酸小檗堿對照品和鹽酸巴馬汀對照品( 均購于中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110713 - 200609 和110732 - 200506) ，鹽酸黃連堿對照品( 南京澤郎科技有限公司，批號200803) ; 乙腈為色譜純; 乙酸銨、冰乙酸、甲醇為分析純; 二純水為MilliQ 純化水系統制備; 黃連藥材( 20101001) 、黃連藥材( 20101201) 分別由天津天士力現代中藥資源有限公司采購自重慶石柱，經中國藥科大學馮鋒教授鑒定分別為黃連( Coptis chinensis Franch) 和三角葉黃連( Coptisdeltoidea C Y Cheng et Hsiao) ; 姜黃連( 20101202) 、酒黃連( 20101203) 、萸黃連( 20101204) 三種炮制品為黃連藥材( 20101001) 在天津市興達中藥材加工廠炮制加工而成。
1. 2 儀器BP - 110S 型電子天平( Sartorius) ，Milli -Q 超純水系統( Millipore) ，1100 型高效液相色譜儀( Agilent) ，LC /MSD Trap system( Agilent) ，Zorbax SB -C18( 250 mm × 4. 6 mm，5 μm) 色譜柱( Agilent) ， IKA -MF10 型粉碎機( IKA) 。
2 方法與結果
2. 1 色譜條件流動相A 為乙腈，流動相B 為20mmol /L 乙酸銨- 0. 5%醋酸水溶液，流速1. 0 ml /min，梯度洗脫: 0 min ( A 10%) →10 min ( A 15%) →15 min( A 28%) →30 min ( A 32%) →35 min ( A 32%) ，分析時間為35 min，每次進樣前用A 10%平衡10 min，柱溫30 ℃，檢測波長為345 nm。
2. 2 溶液制備
2. 2. 1 對照品溶液配制精密度稱取對照品適量，加甲醇配制成每ml 含42. 0 μg 鹽酸黃連堿、44. 8 μg 鹽酸巴馬汀和50. 2 μg 鹽酸小檗堿的混合對照品溶液。
2. 2. 2 供試品溶制備黃連藥材或飲片粉碎后過二號篩，精密稱取約0. 20 g 藥材粉末，置具塞錐形瓶內，精密加入50 ml 甲醇- 鹽酸( 100∶ 1) 溶液，稱定重量，密塞，超聲30 min( 功率250 W，頻率40 kHz) ，放冷，加甲醇- 鹽酸( 100∶ 1) 溶液補足失重，搖勻，濾過，精密移取5. 0 ml 續濾液至50 ml 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜( 0. 22 μm) 濾過，即得。
2. 3 系統適應性試
驗分別吸取混合對照品、供試品溶液10 μl，按“2. 1”項下色譜條件檢測。對照品和供試品的色譜圖。結果顯示，鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿色譜峰的理論塔板數均不低于34 927; 供試品中鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿與相鄰色譜峰的分離度分別為2. 87、6. 49 和3. 85，三個成分的分離度良好。
2. 4 標準曲線的制備
分別精密吸取混合對照品溶液1、2、5、10 和20 μl，按“2. 1”項下色譜條件檢測，以對照品進樣量( X，μg) 為橫坐標，峰面積( Y) 為縱坐標，進行線性回歸，線性方程。
2. 5 精密度試驗精密
吸取混合對照品溶液10 μl 按“2. 1”項下色譜條件檢測，重復進樣6 次，6 次進樣峰面積的RSD 黃連堿為0. 87%，巴馬汀為0. 91%，小檗堿為0. 91%; 出峰時間的RSD 黃連堿為0. 02%，巴馬汀為0. 02%，小檗堿為0. 03%，方法精密度良好。
2. 6 穩定性試驗
稱取黃連粉末( 批號20101001)0. 2 g 按“2. 2. 2”項下方法制得供試品溶液，分別于0、2、4、8、16 和24 h 進樣10 μl，6 次進樣峰面積的RSD黃連堿為1. 21%，巴馬汀為1. 13%，小檗堿為1. 06%，黃連供試品溶液24 h 內穩定性良好。
2. 7 重復性試驗
取黃連粉末( 批號20101001) 6 份，按上述供試品制備方法和HPLC 方法檢測，6次含量測定得到3 個成分含量的RSD 黃連堿為2. 34%，巴馬汀為1. 90%，小檗堿為1. 33%。
2. 8 加樣回收率
試驗精密稱取對照品適量，加甲醇- 鹽酸( 100∶ 1) 溶液配置成每ml 含0. 055 2 mg 鹽酸黃連堿、0. 036 2 mg 鹽酸巴馬汀和0. 128 6 mg 鹽酸小檗堿的加標對照品溶液，精密稱取約0. 10 g 黃連藥材粉末加入錐形瓶，精密加入上述加標對照品溶液50ml，按“2. 2. 2”項下方法從“稱定重量，密塞”起制備加標供試品溶液，平行6 份，按上述方法檢測，計算回收率。鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的平均回收率依次為98. 7%、97. 6% 和102. 3%，RSD 依次為2. 47%、2. 10%和1. 62%。
2. 9 樣品測定
取黃連藥材兩批，3種黃連炮制品各一批，每批樣品平行兩份，按“2. 2. 2”項下方法制備供試品溶液，按“2. 1”項下色譜條件檢測。黃連藥材及黃連三種炮制品的生物堿含量測定結果，可見各樣品的生物堿含量差異較小，炮制對樣品中生物堿含量無明顯影響。
2. 10 LC - DAD - ESI - MS 分析方法
液相分析條件同“2. 1”項，DAD 檢測器記錄190 ～ 400 nm 紫外吸收光譜; 離子化方式為電噴霧離子化( ESI) ，干燥氣體N2，流量12 L /min，霧化器壓力50 psi，脫溶劑干燥溫度350 ℃，質譜檢測器為離子阱檢測器( Ion - Trap) ，掃描范圍: m/z 50 ～ 1 100。
2. 11 LC - MS 檢測樣品處理
稱取黃連粉末10 g，加入150 g 純化水，稱定重量，加熱回流提取30 min，冷卻至室溫，加入純化水補足失重，濾紙過濾，精密移取續濾液1 ml 置50 ml 量瓶中，加純化水定容至刻度，用微孔濾膜( 0. 22 μm) 濾過，即得樣品溶液。取樣品溶液10 μl 按“2. 10”項下方法檢測。
2. 12 LC - DAD - ESI - MS 檢定黃連中成分
結果樣品的紫外吸收色譜圖和總離子，本實驗中的HPLC 方法對黃連中物質的分離度和峰形良好。對主要色譜峰190 ～ 400 nm 的吸收特征分析顯示黃連中7 個峰分為兩類，1號峰( λmax = 270，305 nm) 吸收特征與木蘭花堿的吸收特征相似; 2 ～ 7 號峰分別在255 ～ 270 nm 和345 ～ 360 nm 之間有兩個最大吸收帶，吸收特征與小檗堿相似，見圖4。根據各高效液相色譜峰的紫外吸收和質譜裂解規律，從7 個色譜峰中鑒別出8 個成分，包括一個阿樸啡類生物堿和7個原小檗堿類生物堿。討論2010 版《中國藥典》黃連含量測定項中流動相需添加0. 4% SDS 做離子對試劑，SDS 在流動相中的溶解性對溫度和有機相比例敏感，溫度降低或流動相比例發生變化都有可能析出堵塞管路，SDS 具有對C18填料有改性作用、難揮發、不適合LC - MS 分析等局限。本實驗使用分子量小、溶解度好、易揮發的乙酸銨代替SDS 改善生物堿的分離度和峰形，可以避免以上問題。
實驗中比較了等度洗脫與梯度洗脫，梯度洗脫分離度較好; 還比較了20 mmol /L 醋酸銨，與100mmol /L醋酸銨的區別，兩個濃度的分離度和線性范圍無顯著區別，所以選擇鹽濃度較低的20 mmol /L 醋酸銨作為離子對試劑，使用梯度洗脫方法。本實驗建立的方法能同時測定黃連中小檗堿、巴馬汀和黃連堿3 個主要成分的含量。方法學考查結果顯示，該方法穩定、可靠，可用于黃連及黃連炮制品質量的控制和評價。實驗中還用HPLC - MS 對黃連樣品進行了分析，通過質譜數據得到的峰歸屬結果與標準品比對相附，黃連藥材樣品中5、6、7 號峰為純物質峰，進一步證明了本實驗中色譜方法的準確性。相對于前人用醋酸- 醋酸銨改善黃連生物堿分離效果的研究，本方法分離度和峰形均有較大的改善，并測定了含量相對較多的黃連堿的含量。
本實驗的方法比2010 版《中國藥典》中黃連項少測定了一個表小檗堿成分; 但小檗堿、巴馬亭和黃連堿均為黃連中含量較多的生物堿，3 個生物堿的含量之和占了黃連生物堿中的大部分，控制這3 個成分的含量也能在很大程度上保障黃連及含黃連制劑的質量。并且有多數含黃連的復方制劑在黃連生物堿中只需要控制小檗堿的含量。本實驗的方法有很大的應用空間。
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