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談大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除作用論文
大黃是蓼科大黃屬多年生草本植物掌葉大黃(R.pal?matum)、唐古特大黃(R.palmatum var.tanguticum)或藥用大黃(R.officinale)的根和根莖，其主要有效成分為蒽醌類化合物。蒽醌類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，Ⅱ型豬鏈球菌為一種常見的病原微生物，它在自然界中分布廣泛，可引起人、豬、牛、馬、羊和禽等多種動物感染。在人的感染中，豬鏈球菌常導致化膿性腦炎、心內膜炎、關節炎、肺炎和眼內炎等疾病，是感染生豬飼養人員和屠宰加工人員的常見細菌。近年來的研究表明Ⅱ型豬鏈球菌具有形成生物被膜的能力，這會造成疾病感染的持續性和徹底治愈的困難，因此尋找和研究藥物對生物被膜的消除作用對疾病的治療具有重要的意義。
1 材料與方法
1.1 儀器與設備
YXQ-LS-50S11 型高壓滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);HZQ-F160 全溫震蕩培養箱(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司);無菌凈化工作臺(蘇州蘇凈集團空氣技術有限公司);S-3400N 掃描電鏡(日本);電子天平(上海博訊實業有限公司醫療設備廠Sartorius 公司);酶標儀(南京華東電子);超聲震蕩儀(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);96 孔板(海門市天龍實驗器材制造廠);6 孔板(海門市天龍實驗器材制造廠)。
1.2 試劑與材料
試劑：THB培養基(中國檢驗檢疫科學研究院北京陸橋技術有限公司);結晶紫(天津市風船化學試劑有限公司);冰乙酸(天津市風船化學試劑有限公司);甲醇(天津市風船化學試劑有限公司);乙醇(天津市風船化學試劑有限公司);磷酸氫二鈉();磷酸二氫鈉()。標準2型豬鏈球菌菌株ATCC700794，購于美國菌種保藏中心;大黃飲片(掌葉大黃(R.palmatum))，購于同仁堂藥店。
1.3 方法
1.3.1 大黃水提物的制備
取大黃100 g ，粉成粗粉，加水1L，浸泡過夜，煎煮1 h，紗布過濾，濾渣加水500 ml 同法煎煮30 min，紗布過濾，合并藥液，濃縮，真空干燥，稱重，研成細粉，即得。
1.3.2 豬鏈球菌生物被膜的培養與觀察
取豬鏈球菌菌株ATCC700794 接種于THB 培養基中，37 培養過夜，再用THB培養基稀釋菌液濃度為約1.0×106cfu·mL-1，取100μL加入含有無菌蓋玻片的6孔板，37 培養72 h，取出蓋玻片，滅菌生理鹽水沖洗除浮游菌，戊二醛4固定1 h，0.1mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.2)沖洗兩次后，乙醇脫水，冷凍干燥。樣品表面真空條件下鍍一層厚100～150A的金屬膜，SEM下觀察豬鏈球菌生物被膜形態。
1.3.3 考察不同濃度大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除作用
用96 孔板培養豬鏈球菌生物被膜，并在培養好的96 孔板中分別加入濃度為，31.2 mg/mL,15.6 mg/mL,7.8 mg/mL和3.9 mg/mL 的大黃水提物，37 培養24 h，無藥組為陰性對照組。用移液槍棄去96 孔板中的游離菌，滅菌的PBS(pH 7.2)輕輕洗滌三次，甲醇固定，結晶紫染色，棄去染色液，PBS(pH 7.2)清洗三次，加入33%的冰乙酸溶液，振蕩器10 min，595nm 處酶標儀測定OD 值。
1.3.4 考察大黃提取物的不同加入時間對豬鏈球菌生物被膜的消除作用
用96 孔板培養豬鏈球菌生物被膜，并在培養好的96 孔板中加入濃度為7.8 mg/mL 的大黃水提物，37 培養不同時間6 h、12 h 和24 h，無藥組為陰性對照組。用移液槍棄去96 孔板中的游離菌，滅菌的PBS(pH 7.2)輕輕洗滌三次，甲醇固定，結晶紫染色，棄去染色液，PBS(pH 7.2)清洗三次，加入33%的冰乙酸溶液，振蕩器10 min，595nm 處酶標儀測定OD 值。
2 結果與分析
2.1 豬鏈球菌生物被膜的形態觀察
使用掃描電鏡法觀察豬鏈球菌菌株ATCC700794 培養72 h 后的生物被膜形成狀態。觀察到大量細菌粘附于無菌蓋玻片的表面，且這些細菌被胞外基質如多糖、纖維蛋白、脂蛋白和核酸等物質緊密包裹，形成了具有空間結構的團塊狀物質，而生物被膜是指細菌被自身所產生的胞外多糖基質、脂蛋白、纖維蛋白等所包裹的細胞形態的結構群落，因此顯示的細菌形態表明豬鏈球菌菌株ATCC700794培養72 h后形成了生物被膜。
2.2 不同濃度大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除影響
利用TCP 法考察了濃度為31.2 mg/mL,15.6 mg/mL,7.8mg/mL 和3.9 mg/mL 大黃水提物對對豬鏈球菌生物被膜的消除影響。
2.3 大黃提取物的作用時間對豬鏈球菌生物被膜消除的影響
利用TCP 法考察了濃度為7.8 mg/mL 的大黃水提物與豬鏈球菌生物被膜的作用時間對豬鏈球菌生物被膜的消除影響。
3 討論
采用了掃描電鏡法對豬鏈球菌菌株ATCC700794 生物被膜的形成進行了形態學的觀察，以此判定豬鏈球菌生物被膜形成最佳培養條件，試驗中還對培養12 h、24 h 和48 h時生物被膜的形成情況進行考察，發現培養72 小時生物被膜形成最佳。
采用TCP法測定不同濃度大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除影響，發現生物被膜的消除具有劑量依賴性，當濃度大于7.8 mg/0mL時大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜具有良好的消除作用。同時本研究也對藥物的作用時間進行了考察，發現大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除具有時間依賴性，當作用時間大于12 h 時，大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜具有良好的消除效果。以上實驗數據為大黃提取物在臨床上的使用提供重要實驗依據。
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