談黃芪和三七有效成分對腦缺血再灌注后細胞凋亡的影響論文
腦缺血再灌注損傷( Cerebral ischemia-reperfusioninjury，CIR) 是指缺血腦組織在恢復血液灌注后，腦組織損傷進一步加重的現象。腦缺血后神經細胞的損傷形式可分為急性損傷和遲發性損傷，而細胞凋亡是導致遲發性損傷的主要病理機制。細胞凋亡是細胞在相關基因的控制下進行的自主的程序化的死亡過程。在凋亡過程中，半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶( cysteine aspartic acid specific protease，caspase) ，起到重要的調控作用。caspase-3 是caspase 家族中重要成員之一，是細胞凋亡過程中最主要的終末效應部分，是細胞凋亡的必經之路，故caspase-3 表達上調可作為細胞凋亡的標志。
依達拉奉是一種腦保護劑，其主要作用是清除自由基，抑制脂質過氧化，保護腦、血管內皮和神經細胞避免氧化損傷，臨床上主要用于治療腦梗死，具有確切的臨床療效。近年來有研究表明，依達拉奉可明顯減少急性腦缺血再灌注大鼠腦神經細胞凋亡數，故選擇其作為本研究的陽性對照藥。
中醫認為氣虛血瘀是缺血性中風的主要病理機制，故可用益氣活血法進行治療。黃芪是常用的益氣藥，三七是常用的活血藥，二者配伍，符合益氣活血的治療原則。中藥藥化研究發現，黃芪中具有抗腦缺血作用的主要有效成分為黃芪甲苷( 以下簡稱ASTⅣ) ; 三七中具有抗腦缺血作用的主要有效成分包括人參皂苷Rb1( 以下簡稱Rb1) 、人參皂苷Rg1( 以下簡稱Rg1) 和三七皂苷R1( 以下簡稱R1)。本研究從腦缺血再灌注后神經細胞凋亡方面探討黃芪和三七有效成分配伍抗腦缺血的作用機制，探索黃芪和三七有效成分配伍的組方規律，尋找其抗腦缺血的有效配伍組合，為黃芪和三七的進一步合理開發應用提供科學的實驗依據。
1 材料與方法
1. 1 實驗藥物與試劑
三七皂苷R1 對照品( 批號: 12051001，規格:20 mg /支) 、黃芪甲苷對照品( 批號: 12061101，規格:20 mg /支) 、人參皂苷Rb1 對照品( 批號: 12051001，規格: 20 mg /支) 、人參皂苷Rg1 對照品( 批號:12052401，規格: 20 mg /支) ，以上藥品均由成都曼思特生物科技有限公司提供。依達拉奉( 批號: 80-090711，規格: 10 mg /支) ，由南京先聲東元制藥有限公司提供，給藥時用0. 9%氯化鈉稀釋，配成0. 4 mg /mL 溶液。蛋白質抽提試劑盒( 產品貨號: KeyGEN，由南京凱基生物科技發展有限公司提供) 、BCA 蛋白質定量試劑盒( 產品貨號: AR0146，由武漢博士德生物工程有限公司提供提供) 、細胞凋亡檢測試劑盒Ⅲ( FITC)( 產品貨號: MK1023，由武漢博士德生物工程有限公司提供) 、磷酸酶抑制劑復合物Ⅲ ( 產品貨號:C500019-0001，由上海生工生物工程股份有限公司提供) ; 兔抗小鼠Caspase-3 抗體( 批號: SC7148，購自Santa Gruz Biotechnology) ，兔抗小鼠β-actin 抗體( 批號: sc-130656，購自Santa Gruz Biotechnology) ，均4℃保存; HRP-Goat Anti-Rabbit Ig ( H + L ) ( 批號:SA00001-2，購自Proteintech Group) ，- 20 ℃保存。
1. 2 動物、分組及給藥方法
88 只SPF 級C57BL /6 小鼠，雄性，體重20 ～25g。飼養于SPF 級動物實驗室，相對濕度40% ～60%、溫度20 ～ 26 ℃。根據前期實驗結果[9]，隨機分為以下11 組: 1. 假手術組，2. 模型組，3. 黃芪甲苷組，4. Rg1 組，5. Rb1 組，6. R1 組，7. 四種有效成分配伍組，8. 黃芪甲苷+ Rg1 組，9. 黃芪甲苷+ Rb1 組，10.黃芪甲苷+ R1 組，11. 陽性對照藥依達拉奉組。各組給藥劑量: 1、2 組0. 5%羧甲基纖維素鈉10 mL /kg; 3組AST Ⅳ40 mg /kg; 4 組Rg1 50 mg /kg; 5 組Rb1 40mg /kg; 6 組R1 10 mg /kg; 7 組AST Ⅳ和Rb1 各40mg /kg，Rg1 50 mg /kg，R1 10 mg /kg; 8 組AST 40 mg /kg，Rg1 50 mg /kg; 9 組AST Ⅳ和Rb1 各40 mg /kg; 10組AST 40 mg /kg，R1 10 mg /kg; 11 組依達拉奉4 mg /kg。第1 - 10 組均灌胃給藥，1次/d; 第11 組腹腔注射給藥，2次/d。連續給藥3 d，末次給藥1 h后進行造模。
1. 3 腦缺血模型制作
乙醚麻醉小鼠，仰臥位固定，頸部手術，用動脈夾夾閉頸總動脈20 min，造成腦缺血。假手術組也進行頸部手術，但不夾閉雙側頸總動脈。再灌注24 h 后，將小鼠迅速斷頭，取出腦組織做相應指標檢測。
1. 4 神經元凋亡檢測
取視交叉后腦組織，固定、脫水、石蠟包埋，作冠狀切片，厚度約為7 μm，TUNEL 法測定神經細胞凋亡，計算凋亡率( %) 。
1. 5 caspase-3 蛋白表達檢測
取視交叉前腦組織，裂解、離心。采用BCA 法進行蛋白質定量，并計算含110μg 蛋白的裂解液容積作為上樣量。western-blot 法檢測caspase-3 蛋白和內參照蛋白β-actin 的表達。用Image-Pro Plus 6. 0 圖像分析軟件測定caspase-3 和內參蛋白( β-actin) 的累積光密度值( IOD) ，并以兩者IOD 的比值作為caspase-3 的相對表達量。
1. 6 統計分析方法
實驗數據采運用SPSS16. 0 統計軟件進行統計分析。各組均數采用單因素方差分析，方差齊者用最小顯著性差異法檢驗。P < 0. 05 為有統計學意義。
2 結果
2. 1 各組神經元凋亡率
各組神經元凋亡率的比較見圖1。與假手術組比較，模型組凋亡率顯著升高( P < 0. 01) 。與模型組比較，各給藥組凋亡率顯著降低( 均P < 0. 01) 。ASTⅣ + Rg1 組與AST Ⅳ + R1 組降低凋亡率的效應分別大于各有效成分單用組( 均P < 0. 01) 。四種有效成分配伍組降低凋亡率的效應大于四種有效成分單用組及AST Ⅳ + Rb1 組( 均P < 0. 01) ，與陽性對照藥依達拉奉組、AST Ⅳ + R1 組、AST Ⅳ + Rg1 組比較，差異無統計學意義( 均P > 0. 05) 。2. 2 各組腦組織caspase-3 蛋白表達各組腦組織caspase-3 蛋白表達的比較見圖2。與假手術組比較: ◇P < 0. 05，◇◇ P < 0. 01; 與模型組比較:△P < 0. 05，△△P < 0. 01; 與AST Ⅳ組比較: * P < 0. 05，** P<0. 01; 與Rg1 組比較: □P < 0. 05，□□ P < 0. 01; 與Rb1 組比較: P < 0. 05，P < 0. 01; 與R1 組比較: ☆ P < 0. 05，☆☆ P <0. 01; 與四種有效成分配伍組比較:P < 0. 05，P < 0. 01a. caspase-3 蛋白表達的western-bloting 圖譜; b. caspase-3 蛋白表達的比較圖2 各組腦組織caspase-3 蛋白表達的比較( 珔x ± s，n = 8) 與假手術組比較，模型組caspase-3 表達顯著升高( P < 0. 01) 。與模型組比較，各給藥組caspase-3 表達顯著下降( 均P < 0. 01) 。AST Ⅳ + Rg1 組與ASTⅣ + R1 組降低caspase-3 表達的效應分別大于各有效成分單用組( P < 0. 01 或P < 0. 05) 。四種有效成分配伍組降低caspase-3 表達的效應大于各有效成分單用組、AST Ⅳ + R1 組及AST Ⅳ + Rb1 組( P < 0. 01或P < 0. 05) ，與陽性對照藥依達拉奉組、AST Ⅳ +Rg1 組比較，差異無統計學意義( 均P >0. 05) 。
3 討論
本研究結果顯示，對小鼠進行腦缺血再灌注處理后，其腦組織發生細胞凋亡，caspase-3 蛋白表達增加。黃芪與三七的各種有效成分單用及配伍均可減輕缺血再灌注后神經細胞的凋亡，降低凋亡率，減少caspase-3 蛋白的表達。AST Ⅳ + Rg1 與AST Ⅳ + R1降低凋亡率和減少caspase-3 蛋白表達的效應分別大于各藥物單用，表明黃芪甲苷與人參皂苷Rg1 或三七皂苷R1 配伍對神經細胞凋亡的抑制作用增強，可能具有協同增效作用。四種有效成分配伍降低凋亡率的效應大于四種有效成分單用及AST Ⅳ + Rb1，減少caspase-3 蛋白表達的效應大于四種有效成分單用及AST Ⅳ + Rb1 和AST Ⅳ + R1，表明四種有效成分配伍能增強抗細胞凋亡的效應。以上分析結果提示黃芪甲苷與三七的有效成分可以抑制腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的發生，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍、黃芪甲苷與三七皂R1 配伍以及四種有效成分配伍對細胞凋亡的抑制作用增強。
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