獻血者EBV、HHV?6和HHV?7 DNA檢測對輸血意義
作者：楊永潔 尼宏莉 李欣 王笑峰 王云 于琦 羅兵
【摘要】 目的 了解青島地區獻血者單個核細胞（PBMC）和唾液標本中EB病毒(EBV)、人皰疹病毒6型(HHV?6)和人皰疹病毒7型(HHV?7)的感染情況。方法 采用PCR?Southern blotting檢測109名健康無償獻血者外周血PBMC和唾液標本中EBV DNA，巢式 PCR技術檢測HHV?6和HHV?7 DNA，限制性酶切分析分別對HHV?6、HHV?7進行分型和鑒定。結果 109名獻血者外周血PBMC中EBV DNA檢出率為21.10%(23/109)，HHV?6 DNA檢出率為50.46%(55/109)，HHV?7 DNA檢出率為57.80%(63/109)。唾液標本中EBV、HHV?6和HHV?7 DNA檢出率分別為24.77%(27/109)、 66.06%(72/109)和90.83%(99/109)。PBMC中EBV、HHV?6和HHV?7均陽性者7例，占6.4%；唾液標本中均陽性者17例，占15.6％。酶切分析結果顯示，55例獻血者外周血PBMC HHV?6陽性標本中HHV?6A型占18.2%(10/55)，HHV?6B型占81.8%(45/55)；72例唾液HHV?6陽性標本中HHV?6A型占16.7%(12/72)，HHV?6B型為83.3%(60/72)。結論 外周血PBMC和口咽部上皮細胞是EBV、HHV?6和HHV?7潛伏的重要部位，獻血員中存在上述病毒的共感染。
【關鍵詞】 皰疹病毒4型,人；皰疹病毒6型，人；皰疹病毒7型，人；輸血
�。跘BSTRACT］ Objective To investigate the prevalence of EBV,HHV?6 和 HHV?7 in peripheral blood mononuclear cel1s (PBMC) and saliva samples in blood donor. Methods PCR?Southern blotting was adopted to detect EBV DNA in PMBC and saliva of 109 blood donors in Qingdao; nested?PCR method to detect HHV?6 and HHV?7 DNA; restriction map to type and identify HHV?6 and HHV?7. Results Of the 109 blood donors, the detection rates of EBV DNA, HHV?6 DNA and HHV?7 DNA in PMBC were 21.10% (23/109), 50.46% (55/109) and 57.80% (63/109), respectively; in saliva, the rates were 24.77% (27/109),66.06% (72/109) and 90.83% (99/109), respectively. In PBMC, seven cases were with all the three items, EBV,HHV?6 and HHV?7, were positive, accounting for 6.4% (7/109); in saliva, the positive case was 17, accounting for 15.6％ (17/109). Restriction enzyme analysis revealed that 18.2% (10/55) of HHV?6A in PBMC and 16.7% (12/72) in saliva, 81.8%(45/55) of HHV?6B in PBMC and 83.3%(60/72) in saliva. Conclusion Peripheral blood mononuclear cel1s and epithelial cells of pharynx oralis are the important latent sites for EBV,HHV?6 and HHV?7. Co?infection of EBV with HHV?6 and HHV?7 exists in blood donors.
�。跭EY WORDS］ herpesvirus 4, human; herpesvirus 6, human; herpesvirus 7, human; blood transfusion
輸血治療是臨床醫學的重要手段之一，但輸血并不是有益無害的治療手段，也不是絕對安全的[1]。輸血所致病毒感染一直為國內外輸血界所關注，因此，與輸血相關的病毒感染的危險性及檢測病毒基因組的價值已成為醫學領域中一個研究熱點[2]。EB病毒（EBV）、人皰疹病毒6型（HHV?6）和7型（HHV?7）同屬于人皰疹病毒科，原發感染后在宿主體內長期潛伏，可因輸血或某些癥狀性疾病而激活，增加其再活動的危險度。大部分健康成人感染并攜帶EBV、HHV?6和HHV?7，病毒可持續存在于外周血細胞和唾液腺細胞中，而且唾液中可分泌具有感染性的病毒顆粒，對人體產生持久而穩定的感染。本研究采用PCR?Southern blotting檢測109名健康無償獻血者外周血單個核細胞(PBMC)和唾液標本中EBV DNA，巢式 PCR(nested?PCR)技術結合限制性酶切分析檢測其HHV?6和HHV?7 DNA，以調查獻血員EBV、HHV?6和HHV?7的感染狀況，分析其是否存在共感染及對輸血的意義。
1 材料與方法
1.1 樣本來源
隨機采集青島地區109名無償獻血者外周靜脈血 10 mL (枸櫞酸鈉抗凝，比例1∶9)和唾液5 mL。109名獻血者丙氨酸轉氨酶（ALT）≤25 U(賴氏法)，HBsAg、抗?HCV、抗?HIV和梅毒螺旋體抗體均陰性，其他項目也均符合國家規定獻血標準。
1.2 標本DNA的提取
枸櫞酸鈉抗凝血分離PBMC，唾液標本離心取沉淀，分別加入2 mL裂解緩沖液（含10 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100 mg/L 蛋白酶K，1 g/L SDS），55 ℃消化2 h。采用酚?氯仿?異戊醇法常規提取細胞DNA，干燥后以TE緩沖液（pH 8.0）溶解，4 ℃保存備用。
1.3 EBV、HHV?6和HHV?7 DNA的檢測
EBV特異性引物和探針參照文獻[3]設計，上游引物序列為5′?CCAGACAGCAGCCAATTGTC?3′，下游引物序列為5′?GGTAGAAGACCCCCTCT?TAC?3′，探針序列為5′?CCCTGGTATAAAGTGGTCCTGCAGCTATTTCTGGTCGCATC?3′，擴增產物的長度為129 bp。PCR擴增的反應體系及Sou?thern boltting檢測EBV DNA均參考文獻[3]方法進行。巢式PCR擴增HHV?6 和HHV?7 DNA內外側引物的設計和擴增條件分別參考文獻[4?5]進行，HHV?6外側擴增產物長度為287 bp，內側擴增產物長度為163 bp；HHV?7外側擴增產物長度為186 bp，內側擴增產物長度為124 bp。
1.4 HHV?6限制性酶切分型和HHV?7鑒定
HHV?6酶切反應的體積為20 μL，包括10×buffer 2 μL，PCR擴增產物10 μL，限制性核酸內切酶Hind Ⅲ 10 U，去離子水補充體積至20 μL，混勻后瞬時離心，37 ℃水浴12～16 h。取酶切產物10 μL于120 g/L聚丙烯酰胺凝膠中80 V垂直電泳1 h，凝膠用EtBr （0.5 mg/L）染色20 min，紫外線透射儀下觀察并記錄電泳結果。HHV?6A可觀察到66 bp和97 bp的條帶，而HHV?6B未被消化，為163 bp的PCR擴增條帶。HHV?7 PCR擴增產物采用限制性核酸內切酶EcoRⅠ進行酶切鑒定，反應條件和電泳條件同上，HHV?7特異性PCR擴增產物可觀察到45 bp和79 bp的兩條帶。
2 結果
2.1 EBV DNA的PCR?Southern檢測
本文109名獻血者 PBMC中EBV DNA陽性23例，陽性率為21.10%；唾液標本中EBV DNA陽性27例，陽性率為24.77%；PBMC和唾液標本中均陽性者4例，合計陽性率42.2%（46/109）。見表1、2。部分標本PCR?Southern結果見圖1。獻血員EBV、HHV?6和HHV?7感染狀況見表2。PBMC和唾液標本中EBV檢出率差異無顯著性(χ2=0.42，P>0.05)，而HHV?6和HHV?7在唾液標本中的檢出率明顯高于PBMC標本，差異有顯著性（χ2=5.45、31.14，P<0.05、0.01）。
2.2 HHV?6 DNA檢測結果和分型
109例獻血員外周血PBMC中外側PCR均未檢測到HHV?6基因組，內側PCR擴增有55例HHV?6 DNA陽性，陽性率為50.46%（55/109）；唾液標本中外側PCR擴增有2例陽性，內側PCR擴增有70例HHV?6 DNA陽性，陽性率為66.06%（72/109），PBMC和唾液標本均陽性者34例，合計陽性率85.32%（93/109），見表1、2。部分外周血PBMC標本和唾液標本HHV?6內側PCR擴增結果見圖2。PCR產物酶切分析顯示，外周血PBMC HHV?6陽性的標本中，HHV?6A型占18.2%(10/55)，HHV?6B型占81.8%(45/55)；而在72例唾液HHV?6陽性的標本中，HHV?6A型占16.7%(12/72)，HHV?6B型占83.3%(60/72)，本文未觀察到HHV?6A和HHV?6B均為陽性者。
2.3 HHV?7 DNA的檢測與鑒定
本文109例獻血員外周血PBMC中外側PCR擴增有21例標本HHV?7 DNA陽性，內側PCR擴增有42例HHV?7 DNA陽性，陽性率為57.80% (63/109)；在唾液標本中，外側PCR擴增有85例HHV?7 DNA陽性，內側PCR擴增有14例陽性，陽性率為 90.8%（99/109）；在PBMC和唾液標本中，HHV?7 DNA均陽性者共有63例，其合計陽性率為90.8%（99/109）。見表1、2。部分外周血PBMC和唾液標本HHV?7內側PCR擴增結果見圖3。表1 109例獻血員PBMC和唾液標本中EBV、HHV?6和HHV?7檢出率、表2 109例獻血員PBMC和唾液標本中EBV、HHV?6和HHV?7感染情況（略）
2.4 EBV、HHV?6和HHV?7共感染狀況
109名獻血員外周血PBMC中EBV、HHV?6和HHV?7均陽性者7例，占6.4%；唾液中均陽性者17例，占15.6％。本文有58.7%的獻血員同時感染HHV?6和HHV?7，而單獨感染EBV的獻血員較少，在外周血和唾液標本中分別只占2.75%和0.92%，唾液標本中僅有1名獻血員3種病毒DNA檢測均為陰性。見表3。表3 獻血員血液、唾液EBV、HHV?6和HHV?7共感染狀況分析（略）
3 討論
EBV、HHV?6和HHV?7分別屬人皰疹病毒科γ和β亞科成員，其原發感染通常發生在嬰幼兒和兒童期，原發感染后可在體內形成潛伏感染，主要通過唾液傳播，也可經輸血傳播。由于輸血或外界原因導致機體免疫力下降或免疫功能抑制時潛伏感染狀態的病毒可被激活，導致各種活動性感染。其靶細胞均為免疫細胞，EBV主要侵犯B淋巴細胞，過去認為只有B細胞表面有EBV受體，但進一步研究發現,在腮腺管、咽以及宮頸外的某些上皮細胞亦有EBV受體，因此EBV亦可以感染上皮細胞[6]。HHV?6和HHV?7二者有一定程度的同源性，主要感染CD4+T細胞，在大多數正常人CD4+Ｔ細胞中以潛伏感染的形式存在，病毒被激活后傳播到其他細胞，而唾液腺中不斷產生的病毒可造成低水平持續感染[7]。
本實驗的結果顯示，在109名獻血員中EBV、HHV?6和HHV?7的檢出率均較高，其中HHV?6存在著株差異性，HHV?6的A、B兩個亞型廣泛存在于健康成人及兒童PBMC和唾液中，但在不同疾病中的流行情況有所不同。HHV?6原發感染多為B亞型所致，在幼兒急疹和骨髓移植病人中主要為B亞型，而在艾滋病及淋巴增生性疾病病人中，A亞型的檢出率則遠高于B亞型。健康人群中HHV?6 B亞型毒株感染譜比A亞型廣泛，本研究主要為HHV?6B型，其檢出率為81.72%，與FOX等[9]報道的結果相似，說明B亞型毒株感染譜比A亞型更廣泛。CUENDE等[10]應用巢式PCR檢測獻血員PBMC中HHV?6的陽性率為90%（18/20），其結果明顯高于本研究HHV?6的檢出率，推測健康成人HHV?6的感染率存在地區差異。青島地區獻血員PBMC中HHV?7檢出率為57.8%，與WILBORN等[11]報道的PBMC中HHV?7的陽性檢出率為66.1%（74/112）相似。另外，在部分獻血員血細胞和唾液標本中均可以檢測到EBV、HHV?6和HHV?7 DNA，表明3種病毒感染宿主后可以同時潛伏于唾液腺和PBMC中，并提示唾液和血液均可以傳播病毒[9]。而且唾液中HHV?6和HHV?7的檢出率明顯高于PBMC，提示與血液比較唾液的傳播可能具有更重要的意義。
此外，本研究結果顯示，在健康獻血員中存在EBV、HHV?6和HHV?7的共感染。EBV、HHV?6和HHV?7同屬于人類皰疹病毒家族，在結構上有相似性，在發揮其生物學功能方面也有協同作用。有研究顯示，在DIHS病人中存在EBV、HHV?6和HHV?7的共感染，血清學檢測證實潛伏病毒可再活化，且HHV?6、HHV?7、CMV 和EBV再活化存在協同作用[12]。CHEN等[13]在研究人類皰疹病毒感染的解剖學圖譜時證實，在所有的皰疹病毒中只有EBV、HHV?6和HHV?7在8例不同原因死者(其中2例死于HIV?AIDS)中同時表達，而且是多部位表達，進一步說明EBV、HHV?6和HHV?7存在共感染。
綜上所述，健康獻血員中EBV、HHV?6以及HHV?7的檢出率較高，輸注含有該病毒的血液可能增加受血者的機會性感染，特別是給器官移植病人或免疫功能低下病人帶來危害。采取科學的輸血方式，如輸注去除白細胞制備的成分血，可以最大限度地減少病毒傳播與感染引起的不良后果。探討EBV、HHV?6和HHV?7對降低輸血性疾病的危險性具有重要意義。
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