中華按蚊多態微衛星DNA位點的篩選和特征研究

中華按蚊多態微衛星DNA位點的篩選和特征研究

【摘要】  目的： 對中華按蚊多態的微衛星DNA位點進行分離和篩選，并闡明其特征. 方法： 應用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴增放大，克隆并測序，構建中華按蚊微衛星DNA庫. 在其中挑選合適的微衛星位點，建立擴增體系. 應用中華按蚊現場樣本擴增不同的微衛星位點，聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選具有多態性的微衛星位點. 結果： 構建的中華按蚊微衛星DNA庫中包含252條序列，GenBank注冊登記號為EF620047～EF620298. 其中，雙核苷酸重復最為常見，三核苷酸重復次之，多核苷酸重復少見；含（CA）和（GT）重復的序列最多，重復次數最多可達56次；完整序列占35.3%，非完整序列占20.2%，復合序列占18.7%，其余為非典型序列. 設計了22對引物擴增不同的微衛星位點，其中20個位點產生特異的PCR產物，PAGE結果顯示其中15個位點具有多態性. 結論： 獲得了中華按蚊新的多態微衛星位點共15個，為中華按蚊群體遺傳和其他相關研究提供了分子標志. 
【關鍵詞】  中華按蚊；微衛星DNA
    0引言
    微衛星DNA是一類簡單的短核苷酸串聯重復序列，又稱簡單重復序列，廣泛分布于真核生物的基因組中，每間隔10～50 kb即存在一個微衛星DNA. 微衛星DNA包括核心序列和兩側的側翼序列，通常核心序列重復單元長1～6 bp，重復次數為10～60次，其重復次數的差異導致微衛星DNA具豐富的長度多態性［1-2］. 微衛星DNA已經廣泛應用于研究生物多樣性、群體遺傳結構、行為生態和親緣關系等［3］，是一種理想的的分子標志. 中華按蚊（Anopheles sinensis Wiedemann, 1828）在我國分布廣且種群數量大，是以往文獻記載中瘧疾和絲蟲病的重要傳播媒介［4-5］. 本研究擬構建中華按蚊的微衛星DNA庫并篩選其中多態的微衛星位點，為中華按蚊基因組學研究積累基礎資料，并為其相關研究提供新的分子標志.
    1材料和方法
    1.1材料構建中華按蚊微衛星DNA庫的樣本為上海實驗室品系，由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所提供. 現場中華按蚊采自云南思茅（2005?08，n=10）、云南鹽津（2006?07，n=10）和湖北武漢（2006?07，n=10），選擇雌性成蟲為實驗材料.
    1.2方法
    1.2.1微衛星DNA庫構建基因組DNA的抽提參照Hammond等的文獻進行［6］，-20℃保存待用. 基因組DNA經Sau3AI酶切，回收200～800 bp的片段，加SAUL接頭連接，接頭序列如下：SAULA?：GCGGTACCCGGGAAGCTTGG，SAULB?：GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC. 以SAULA為引物，連接產物作為模板PCR擴增，反應液中含PCR緩沖液、2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.8 μmol/L引物，0.6 U Taq 酶（上海生工生物工程有限公司）和2 μL模板，在熱循環儀（PTC?100，美國ABI公司）上執行如下程序：72℃ 5 min后，94℃ 1 min，67℃ 1 min和72℃ 2 min共32個循環，72℃延伸5 min. 將擴增產物變性后，與Biotin?16?dd UTP（瑞士Roche公司）標記的寡核苷酸探針雜交，探針包括：(AAT)17，(GA)25，(CCT)17，(AC)25，(CAG)17，(CAC)5，(TC)10，(GT)8和(TG)18. 用親和素Vectrex Avidin D（英國Vector Labs公司）捕獲并超濾離心（美國Millipore公司）濃縮富集雜交的目的片段. 以富集的核酸作為模板，SAULA為引物擴增，反應體系和程序同前. 隨后，用PCR產物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴增. 將上述擴增產物插入TOPO?T載體（美國Invitrogene公司），轉化E.coli JM109，挑選含微衛星DNA序列的陽性克隆，用四色熒光標記雙脫氧鏈終止法測序（PE?ABI3770全自動測序儀，上海英駿生物技術有限公司），應用BioEdit（Version 5.0.9）軟件包分析所獲序列.
    1.2.2微衛星DNA多態位點篩選單蚊抽提現場中華按蚊基因組DNA，參照文獻進行分子鑒別確認蚊種為中華按蚊［7］. 選擇22條重復次數較多，且典型的微衛星DNA序列，應用Primer 3（Version 3.1）軟件包設計引物. 以單蚊基因組DNA為模板，PCR擴增微衛星DNA（反應體系和程序同前），退火溫度范圍在55℃～60℃. 擴增產物經5%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染、顯色，依據凝膠上的條帶判斷其是否具有多態性.
    2結果
    2.1中華按蚊微衛星DNA庫構建的中華按蚊微衛星DNA庫中包含282條序列，其中18條序列完全相同，21條序列較短（小于100 bp），故有效的微衛星DNA序列共252條，GenBank注冊號為EF620047～EF620298. 分析所獲的微衛星DNA序列，顯示其長度范圍為50～800 bp，大多數在300 bp左右. 就重復情形而言，雙核苷酸重復最為常見，三核苷酸重復次之，多核苷酸重復少見；含（CA）和（GT）重復的序列最多，重復次數不等，最多可達56次. 所獲的微衛星DNA依據文獻［8］標準劃分，結果完整序列為89條（35.3%），非完整序列51條（20.2%），復合序列47條（18.7%），其余為非典型序列（25.8%）.
    2.2中華按蚊微衛星多態位點設計并合成了22對擴增微衛星DNA的引物，對現場樣本進行擴增的結果顯示，20個位點有特異的PCR產物，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（一條帶為純合子，兩條帶以上為雜合子），共有15個微衛星DNA位點具有多態性（表1）. 本研究的多態微衛星位點在退火溫度為55℃時，均存在特異產物.  表1中華按蚊多態的15個微衛星位點特征
    3討論
    通過比較分析本研究所獲中華按蚊微衛星DNA序列的特點，發現與已報告的岡比亞按蚊（An. gambiae）［9-10］，催命按蚊（An. funestus）［11-12］和穆歇按蚊（An. moucheti）［13］等相似，均為雙核苷酸重復最常見，三核苷酸重復次之，多核苷酸重復少見. 韓國學者Jung等［14］應用(GA)22和(CA)22寡核苷酸探針分離和篩選了韓國的中華按蚊微衛星DNA陽性克隆48個，與之比較，本研究應用了更多的探針，特別是三堿基重復序列的探針，分離的我國中華按蚊微衛星DNA序列，不僅重復單元序列多樣化，而且序列的數量也較多，更具廣泛性，極大地豐富了中華按蚊的微衛星DNA序列數據庫.

   通常一個理想的微衛星DNA標志應具備完整的重復序列，有相當長度的側翼區（至少15 bp）以適合引物設計的需要. 本研究分離的中華按蚊微衛星DNA序列中，絕大部分的側翼區有足夠的長度可供引物設計. 筆者在檢測的22個微衛星位點中，獲得了15個具有多態性，提示中華按蚊微衛星位點的多態性比例較高，為68.2%（15/20），結果與文獻報告的相似，如：韓國的中華按蚊為64.7%(11/17)［14］，催命按蚊為57.4%（27/47）［11］和環跗庫蚊（Culex tarsalis）為60.0%(12/20) ［15］.
    本研究中華按蚊的多態微衛星位點中等位基因數從2到12不等（未發表資料）也與文獻報告的相當［11, 14-15］，篩選得到的中華按蚊多態微衛星位點與韓國學者報告的多態位點無重復性［14］，均為首次報道.
    致謝承蒙湖北省疾病預防控制中心黃光全、云南省寄生蟲病防治所顧云安和第二軍醫大學楊曼尼協助采集現場標本，在此一并表示感謝.
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