聯合作用特征的評價
關鍵字： 聯合作用 評價方法摘 要：多年來，毒藥理界對機體內多種外來化合物產生的聯合作用缺乏統一評價體系。本文就其已有的理論基礎和相關的方法學成就作一概述，旨在介紹各自的使用范圍和優缺點，提請應用者根據條件選用合適的評價方法。
關鍵詞：聯合作用 評價方法
工農業迅猛發展，使得地球上化學物數量不斷增加，人類在生產條件或生活環境中同時接觸或相繼暴露兩種及兩種以上化學物已是相當普遍［1］。為了能取得較好的治療效果，多藥聯用或序貫用藥又是現代臨床醫學的主導趨勢［2］。多種外來化合物共存，勢必對接觸的生物體產生聯合作用(joint action，combined action)，亦稱交互作用(interaction)。盡管在藥理學和毒理學中聯合作用分別發生在不同的劑量水平，對聯合作用特征的正確評價仍是兩門學科工作者的當務之急。
在不同的時期和不同的學科領域，如生物學、藥理學、生物統計學，聯合作用具有不同的含義，特征術語亟待統一和規范化，對其評價方法也不盡相同［3］。Bliss在1939年最早提出獨立、相似和協同三種聯合作用模型［4］。1975年Anderson和Weber把Bliss建立模型應用于水生毒物聯合作用研究［5］，并引入了濃度相加和反應相加的概念。1981年WHO把聯合作用明確分為四類［6］：相加、協同、拮抗和獨立作用，這種分類方法已為多數學者所接受。1988年Rothman等又提出四種不同的聯合作用類型［7］：統計學、生物學、公共衛生學和個體判別的聯合作用，不過沒有被普遍應用。
對同一組資料應用不同的分析方法會得出不同的結論［2］。因而就某組特定的混合物而言，很可能用一種方法計算的結論是相互協同，但用另一種方法計算的結果卻是相互拮抗。關于聯合作用特征的評價，國內外尚未形成統一的認識體系［8，9］。
1 等效應線圖法
1870年Fraser倡導，1926年Loewe加以發展的等效應線圖法［10］，是先用加權直線回歸法求出單獨與混合后的LD50，再求其毒性比例TR值，以TR界值來反映結果性質。在試驗條件和接觸途徑相同的情況下，分別求出兩個化學物的LD50及其95％可信限，用縱、橫坐標分別代表兩種化學物的劑量并將取得的同一效應的劑量(LD50)點相連即為等效線，然后再將兩化學物的95％可信限的上、下限值分別連接。依據混合物實測LD50在兩種化學物可信限上、下連線之間位置判定聯合作用的特征。該法簡單，結果直觀，適用于粗略觀察。但是只能評價兩個化學物的聯合作用，與其嚴密的設計相比信息利用度不夠，也不適用于非概率型效應指標資料。
Checkerboard titration法就是基于等效應線圖法思想的一個延伸［11］，可以從代數和幾何兩個角度加以判斷，Berenbaum同時又將此法推廣到求任意數量藥物的聯合作用。等效應劑量分析會受許多因素的影響，且方法本身往往因為技術上的差錯產生一些差異值，可比性比較差，重復步驟太多。
Finney根據Loewe法的劑量比例原則，提出了以各成分LD50為基礎，評價相似聯合作用的調和平均數模型，來確定混合物的預期LD50。由于簡便易行，經多數學者證實能較好地預測和評價聯合毒性。它是在先求出各化學物的各自LD50值，以各化學物的聯合作用是相加作用的假設出發，按等毒效應劑量預測混合化學物的LD50。用與計算預期PLD50時相同配比的混合物作動物實驗，求出實測半數致死量OLD50和混合物的PLD50與OLD50的比值，即聯合作用系數Q，實測值小于預測值為協同作用，反之為拮抗作用。
Keplinger等用有機磷、有機氯和氨基甲酸酯等15種農藥［12］，按等毒性配比得100多種混合物，分別求得PLD50／OLD50，據此提出了0.57～1.75之間為相加作用的標準。Smyth將27種化學物［13］，同樣按等毒性配比，配成350種混合物，進行小鼠聯合毒性試驗，建議按Finney數學模型計算的Q值在0.40～2.70之間屬相加作用。河合正計、巖原滋利曾用此法對8種殺蟲劑和4種殺菌劑配成28個混合物進行測定［14］，提出不同的Q值評價標準。
采用Finney的Q值評價聯合作用特征［15］，因其毒物種類、實驗條件和動物種屬的差異，以及經驗估計范圍的不同而使之缺乏可比性。Abt等人提出以OLD50／PLD50作為Q值，其具體分界線用其建議的計算偏離‘1’的程度公式，然而計算太繁，應用不便。
Finney法又在生態毒理學中得到應用和擴展［16］，采用等毒性混合法比較預期EC50和實測EC50，由毒性加強指數TEI來評價其特征。Kissinl等提出的分數(代數)分析法［17］，基本思路與等效應線圖法類同，但允許A、B兩藥以任意比例合用，適用范圍廣，國內仍在采用。1977年Marking提出的相加指數法是在濃度相加模式基礎上建立的，需要獲得每個單一毒物的LC50i和在一定比例下幾個毒物混合的LC50i＇，以及1981年荷蘭學者Knemann的聯合毒性指數法幾乎是同一思想［18］。
Moshkovsky曾提出將傳統分類法中的相加作用域定義為完全相加［19］，而從拮抗域中劃分出部分相加和掩蓋作用區。導致部分相加作用的原因，一般認為是毒物在體內的代謝動力學不一致，以及一些用不同順序染毒或時間間隔染毒。于鳴按Moshkovsky分類理論發展了Finney模型［20］，又提出一個新的Q值評價系統，杜絕了Keplinger，Smyth等標準的主觀性和拮抗作用的假陽性。大致過程包括計算各組分及混合物LD50，并由Finney相加作用理論公式求出預期LD50，求出Q值及其標準誤和兩倍誤差的可信限范圍。以此可信限與完全相加理論值1，掩蓋作用理論值1／Pm作比較，判定聯合作用。于鳴應用Q值系統對乙醛和丁烯醛的聯合毒性研究資料進行了分析，結論與采用Finney改良模型的處理結果相吻合。等效應圖解分析法在國外應用較多［21］，思路和求法與Loewe法類同，只是將它轉換成平行線分析，增加了統計學處理［22］。
2 Bliss法
Bliss提出根據劑量對數與死亡概率直線回歸方程［23，24］，以及化學物之間聯合作用模式，確定基本模型表達式：
Ym＝a＋bLog（Q1＋kQ2＋KkQ1Q2）Xm
Ym：混合物的死亡概率，
k：兩種化學物的毒性比值，
Q1，Q2：兩種化學物的百分比，
Xm：混合物的劑量，
K：共毒系數，
a，b：方程的截距和斜率。
結果以相加聯合作用時的死亡概率為標準(理論值)與實測值比較計算共毒系數K，K＞0表示協同作用，K＜0拮抗作用，K＝0相加作用。該法考慮了混合物毒作用機制的差別，能較好地對外來化合物的聯合作用進行定量評價，然而計算太復雜，不便推廣。
3 BÜrgi法
合并用藥在臨床上是普遍使用的治療手段，以往均延用BÜrgi氏規律公式來判斷合并用藥后的最終效應：q＝E［A／2＋B／2］／EA(或EB)，式中E［A／2＋B／2］指A、B兩藥各取半量合用之效應，EA、EB分別為A、B單用之效應，且EA＝EB。Savini即用此法求5HT及腎上腺素的合并作用。
然而，金正均指出上述方程中，分子應采用原始效應之半，分母應考慮兩藥聯合作用時的新情況，并提出金氏修正式：q＝E（A＋B)／（EA＋EB－EA・EB)。式中分子代表實測合并效應，分母是期望合并效應，其意義同Brgi式。修正式的優點是不必取半量或半效，可以直接利用原始效應水平，兩藥效應也不必相同。但只適用于定性試驗。
周元晏等提出兩個新公式：q′＝〔E（A＋B）－EB〕／EA(合并用藥用，要求EA＝EB)，q″＝E′C／EC(序貫用藥用，EC為A藥的對照效應，E′C為在B藥基礎上的A藥效應)，并認為金氏修正式把概率論中衡量兩個獨立事件概率相加的公式來衡量合并用藥效應期望值，缺乏理論基礎，且沒有考慮A、B兩藥在合并前后的內在活性，混淆了效應和概率兩個不同的概念。
Mansour等報道了按等毒法評價二元混合物的聯合毒性［25］。方法是按各化學物預期死亡25％的劑量混合染毒，預期死亡率應為50％，由實測混合物死亡率和預期死亡率計算共毒系數，評價混合物的聯合毒性。Harris等采用按LD50配制二元等毒混合物來評價聯合毒性的方法［26］。測定兩種化合物的LD50及其可信限，按混合比例和各自的LD50值推算預測LD50及其可信限，預測LD50與實測LD50之比。同時根據實測值與預測值的可信區間是否相覆蓋進行分析，相覆蓋者聯合作用較弱，反之則強。
4 等概率和曲線法
有時，合并用藥可利用獨立事件相加概率公式，張效文、金正均提出按效應相加的等概率和曲線法。根據混合物中各化學物的劑量－死亡概率回歸曲線求出預期死亡概率，再對概率求和推算死亡率。Q＝實際合并效果／理論單純相加預期效果。在實驗室中多采用LD50或ED50作為指標，統計量Q50計算：Q50＝0.5／（PA＋PB－PAPB)。兩個以上藥物可先從兩個主藥著手，然后將合并效果作為單一效果，再與其他藥物合并估算。既適合基礎理論研究，又適合聯合用藥臨床療效和副作用的估計。等概率和曲線法能給出合并用藥的全貌，省卻運算時間，有一定理論基礎。以等概率和曲線法求得的LD50值一般比等效線圖法求得的TR值要大［27］，即所判斷的聯合毒性普遍要大于后者。5 方差分析法
近年來，許多毒理學科研人員在研究中采用析因設計的方差分析來判斷外來化合物聯合作用特征。將單因素的劑量-效應曲線和聯合作用的劑量-效應曲線進行重復設計的方差分析，以確定各因素之間有無交互作用［8，29］。如2×2析因試驗是用于兩個因素(兩個藥物或兩種處理方法)［30］，每個因素有兩個水平(用與不用或劑量的不同)的情況。如交互作用不顯著，兩條量效曲線互相平行，則說明兩因素之間具有相加作用。如交互作用顯著，兩曲線隨劑量增大而遠離，兩因素之間具有協同作用。反之，如兩曲線隨劑量增大而靠近或交叉，兩因素之間具有拮抗作用。該方法是一種比較經典的統計方法［31］，它可以直接利用連續的測定結果進行計算，從而充分利用了實驗數據中所含的信息。
6 Logistic模型評價法
黃炳榮等提出的用Logistic模型評價和確定毒物聯合作用的劑量-反應關系［32］，ED50集合及其置信區域等，具有客觀和適用范圍廣的特點，為深入研究毒物聯合作用提供了一種新的方法。其描述毒物聯合作用的Logistic模型的基本形式為：Ln〔P／（1－P）〕＝β0＋β1x1＋β2x2＋β3x1x2，P為反應概率。xi為各毒物的劑量，βi為模型參數，β3是交互作用參數。β3＞0表示協同作用，β3＜0拮抗作用，β3＝0(即β3無顯著性)表示相加作用。βi的極大似然估計值通常是用Newton Raphson選代法求出，Logistic模型ED50及其漸近置信區域可用Carter等的方法估計。根據Hauck的結論S50(B)的1－α保守置信區域可近似地由下式確定：｛ξ∈R2｜PL（x）≤［1＋Exp（1－ξB）］－1≤PU（x）x*∈S50（B）｝
黃炳榮等以硝酸鉛與無水乙醇為例，在計算機上用WLOGIT軟件解出各參數極大似然估計值，結果β3＞0，模型的似然比檢驗說明整個模型有顯著性。擬合適度檢驗P＞0.50可認為模型對數據擬合情況良好。聯合作用劑量-反應關系和LD50集合及其95％置信區域的結果最終可在二維、三維空間中擬合。
選用概率效應指標對聯合作用評價在實際應用中有一定局限性，如對外來化合物長期低劑量暴露，或是在細胞、亞細胞水平觀察的聯合作用進行評價時，就不宜使用LD50或ED50指標。改用非概率指標以后，化學物單獨作用的劑量-效應關系有可能需用非單調型曲線描述，同時效應指標觀察值也無≤1的限制。張俠提出對聯合作用劑量反應關系采用廣義三階多項式回歸模型評價方法［33］：
R（x，y）＝R0＋α1x＋α2x2＋α3x3＋β1y＋β2y2＋β3y3＋γ1xy＋γ2x2y＋γ3xy2交互項之和γ1xy＋γ2x2y＋γ3xy2記為I(x，y)。x、y表示兩種受試物各自的劑量，R（x，y)表示效應指標的觀察值R（x，y)的模擬預測值，R0、αi、βi、γi(i＝1，2，3)是回歸方程的參數。交互項之和及其置信區間估計為：R∧（x，y）－R0－〔（R（x，0）－R0〕＋〔R∧（x，y）－R0）〕＝I（x，y)
從理論上講，I（x，y)＝0即兩種化學物的聯合作用是簡單相加。I（x，y)＞0或＜0分別表示協同或拮抗。I（x，y)的符號是否具有統計學意義可由I（x，y)的1－α置信區間加以判定。以氯化鎘與氯化鎳對豚鼠肺泡巨噬細胞膜的聯合毒性為例進行了演示，判定結果與采用Logistic模型評價結果相一致。
研究固定劑量或固定比例設計下的聯合作用資料時，其單獨或聯合的量-效曲線散點圖是三次拋物線型，其資料符合三階多項式模型的重要特征。已有文獻報道不同效應水平(如ED50，ED60等)所對應的聯合作用特征可能有不一致［34，22］，而該模型卻能成功地解決這一問題。這是三階以下模型所不具備的。使用本法簡單有效，客觀而適用范圍寬。
7 多藥物聯合作用計算機分析法
很多藥物往往不能用較大劑量治療疾病，但為了要達到較好的治療效果常需合并用藥。徐端正提出多藥物合并指標Q（x）及95％可信限［35］，在計算機上對所有反應水平(1％～99％)進行評價，多藥物的合并公式：
�。╬1／D1x＋p2／D2x＋pn／Dnx)Dcx＝Q（x）
d1／D1x＋d2／D2x＋…dn／Dnx＝1
應用Bliss法可求出幾個藥物在合并前后的任何反應水平x％的等效劑量D1x、D2x、…Dnx及Dcx，利用計算機可繪出Q（x）曲線，Q（x)的標準誤公式可用函數方差原理導出。其中Scx2為Dcx的估計方差，Six2為Dix的估計方差。利用Q（x）的95％可信限公式：Q（x）±1.96SE〔Q（x）〕，繪出以Q（x）曲線為中心的兩條95％可信限曲線，在上、下限曲線范圍內包含水平線Q（x）＝1為相加作用。
Finney在1962年最先提出，Plummer和Short后又加以改進的多藥物聯用的計算機分析模型［36］，區分相加作用中的協同還是拮抗，適用于質反應或量反應(經概率單位或對數轉換)資料，不須預先掌握精確的等效劑量信息，對數劑量-反應曲線不再拘泥于平行關系，對單藥或具有相同效應的多藥合用同樣適用，具體表達式為：Y＝β0＋β1lg［A＋P・B＋β4（A・P・B)1／2］。Y是反應，A、B為兩藥的劑量，P為相對效率，可由lg（P）＝β2＋β3lg（B′）求得，B′－B－A／P＝0。如兩藥曲線平行，β3＝0，P為常數。β4＞0判為協同，β4＜0拮抗。對β4應作是否等于0的顯著性檢驗。
8 參數法分析多藥物聯合作用
鄭青山、孫瑞元根據靶體動力學原理［37］，引入藥物等效性檢驗法，建立新的數學模型Q＝（E0-Ee)／｜Ee・W－sx・T｜分析多藥物聯用效果，其中E0為藥物聯用實測效應擬合值，Ee為聯用藥效期望值，W為專業等效標準，一般在臨床試驗和整體實驗中為0.1，體內實驗為0.05，生物利用度實驗為0.2。sx為E0和Ee共同標準誤，T是單側t0.05值，分析用的一組Q值來自于各種水平的劑量-效應關系。本法適用于能用Hill方程進行擬合，且質反應Emax固定為1（100％）的數據。所得結論綜合了專業標準和實驗室誤差的因素，有效地分析多種類型聯用數據，不受聯用藥物數目和是否作用于受體的限制。
9 合并用藥的定量分析法
戴體俊(1998)建議采用如下公式評價合并用藥的效果［38］：
qA＝EA＋BVsEA �。�1）
qB＝EA＋BVsEB （2）
qC＝EA＋BVsEA＋Ab(EB＋Ba) �。�3）
VS表示用藥前后的效應做顯著性檢驗。（1）式若EA＋B大于(小于)EA，且qA的P值＞0.05，定義為B藥對A藥無關；P＜0.05認為A藥被B藥協同(拮抗)。（2）式亦然。（3）是針對A、B兩藥而定的。按等效劑量合并法將A、B合并為一藥A＋Ab（B＋Ba)，再將其實測效應EA＋Ab(EB＋Ba)進行比較。
以上羅列各法對聯合作用進行定性或定量評價，均有各自的使用范圍和優缺點。聯合作用特征又可隨觀察指標(如ED50、死亡率、麻醉以及生理、生化等指標)不同而有差別，實驗結果不宜任意外延。具體應用時須嚴格根據條件選擇合適方法。在基礎理論研究中［39～41］，更多的是從細胞分子水平或在藥代動力學模型上進行評價。
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