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生物酶解破壁提制葛根黃酮的工藝
引言
葛根富含葛根淀粉和總黃酮（含量約為1-12%）。由于我國農作物利用較粗放，葛產業基本上集中在葛根淀粉的提取[1]，淀粉中異黃酮含量僅占葛根總黃酮的2.4％，95％以上尚留在葛根廢渣被丟棄，高附加值的天然活性成分浪費嚴重。作為醫藥和保健食品的原料或添加劑[2]，目前，國際市場葛根黃酮每年需求量約在500－800 噸，在美國，食用酮類食品的人數超過１億３千多萬人；而我國的每年需求量約在150 噸左右。將生物酶促法應用到葛根黃酮的提取，主要是利用微生物充分破壞植物細胞組織結構，將植物組織分解成小分子物質，減少提取傳質阻力，充分釋放活性成分，具有提取物穩定、純度高、能耗低、有機溶劑使用量少等特點[3]；目前，湯海鷗[4]、施英英[5]等采用纖維素酶和木聚糖酶等對提取葛根黃酮進行報道。隨著人們對葛根功能性和營養性研究的深入，采用生物酶化工藝，在減少葛產業集約化發展引起的葛根廢渣環境污染的同時，實現葛根廢渣的資源化利用提供一條新途徑。
1 主要儀器、試劑和測試方法
1.1 儀器與試劑
儀器：UV-2450 紫外可見光光度計，DELTA 320-5pH 計，RE-2000 旋轉蒸發器，126P/166P高效液相色譜儀，SPX-250-Z 振蕩培養箱原料：葛廢渣取至重慶北碚農村（除去葛根淀粉）試劑：葛根素（標品）；乙醇（分析純）、正丁醇（分析純）、硫酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、葡萄糖(分析純)、甲醇(分析純)
1.2 實驗
1.2.1 菌種培育
選用黑曲霉，分別經過斜面培養、種子液體培養后，將培養好的菌種接種裝入液量為60 ml250ml 三角瓶中，接入量為5%，29℃，180rpm，混合培養48h。
1.2.2 微生物酶化提取葛根黃酮
取烘干、粉碎后過40 目篩的葛渣樣品3.5g，加入豆粕1.0g 至250ml 干凈的錐形瓶中，加入蒸餾水，接入一定量種子液, 設定pH 值和發酵時間，考察接種量和培養基質及不同工藝參數對葛根黃酮溶出的影響
1.2.3 主要控制參數及發酵工藝流程
葛根渣與輔料之比為7:2，固液比為1:20，接種量50%，發酵溫度為30℃，發酵時間為60h，pH 值為5，豆粕的重量百分量為5%～25%；接種量為40%；pH 值為6，在30℃下連續反應48h 反應在生化培養箱中進行，間歇通過無菌空氣(平均 10min/h)
1.3 葛根黃酮的測定
采用色譜分析方法[6]測定葛根素標品。精密稱取葛根素標準品5.2mg，經甲醇定容并配置成1.04mg/ml 的標準溶液后，分別移取1ml、0.5ml、250ul、100ul、50ul、25ul、5ul 標準溶液，再用甲醇稀釋并定容至5ml；設定色譜條件為色譜柱C18，柱溫30℃，流動相為：甲醇-水（25：75），檢測波長為250nm，流速為1.0ml/min，進樣體積為10ul；通過分析檢測得出峰面積繪制葛根黃酮的標準曲線。得回歸方程為：y=35415x-14502， R?=0.9993。
2 結果與討論
2.1 不同方法的對比實驗
2.1.1 葛渣不同處理方式對葛根黃酮含量影響
葛根黃酮等植物有效成分大都被包裹在葛渣細胞壁中。微生物能產生木聚糖酶和內切-β-葡聚糖酶(CMC 酶)，破壞葛渣細胞壁的纖維結構，甚至將其分解成小分子物質，減少提取傳質阻力，有效釋放葛根黃酮等活性成分。通過圖2 葛渣不同處理方式的對比可知，采用黑曲霉和康寧木霉發酵36h 后所得葛根黃酮的含量均高于未發酵處理，其中黑曲霉在發酵60h 時葛根黃酮含量達到最高，為1.078ug/ml。
2.1.2 不同發酵方式對葛根黃酮含量影響
不同菌種對生長環境要求不一樣。從圖3 可知，采用黑曲霉進行好氧發酵在每一時段其葛根黃酮濃度均大于厭氧發酵產量，且在60h 時能得到葛根黃酮的最大濃度為1.078ug/ml。
原因在于：黑曲霉生長會產生酶，加快葛渣纖維組織降解能力；在這過程中，充足的氧氣會促使微生物生長，增加酶產生量，從而促進葛渣纖維組織的降解，提高葛根黃酮的溶出量。
此外，通入氧氣還可減少因厭氧發酵造成的惡臭。
2.2 培養基質對葛根黃酮含量的影響
2.2.1 輔料碳氮源對葛根黃酮含量影響
菌種生長有一周期，需要營養底物；如果營養不足，會導致菌種生長所需的能量、碳氮源等成分不足影響生長，減緩纖維素等植物組織分解減緩，阻礙葛根黃酮溶出；但如果營養過剩，又會使菌種提早達到衰亡期，使葛根黃酮溶出受抑制。從圖4 可知，輔料豆粕加入量與葛根黃酮的含量關系呈曲線走勢，3.5g 葛渣，加入豆粕量為1.0g 時，葛根黃酮的含量最大為0.986 ug/ml。
2.2.2 不同接種量及對葛根黃酮含量的影響
設定黑曲霉接種量為原料的20%、30%、40%、50%、60%的比例加入原料中。由圖5可知，接種量為50%即菌液量為1.75ml 時，葛根黃酮的含量最高，為0.529 ug/ml。原因在于菌種含量對葛根黃酮溶出的影響主要表現在如加入的菌種太多，當營養不足時，會加劇菌種之間的競爭，導致太多菌種提前死亡；加入的菌種太少會因營養過剩，還未與植物組織完全發生酶促反應前，便提前達到生長旺盛期頂點，隨之衰亡，凋零。
2.2.3 不同發酵溫度及對葛根黃酮含量的影響
酶類屬于蛋白質類物質，其對溫度大都非常敏感。適宜的溫度不僅可以加快微生物的生長和繁殖，還可以增大酶活性，促進植物纖維的降解。由圖6 可以看出，發酵溫度對葛根黃酮影響很大，在溫度為30°C 時，葛根黃酮含量最高為1.4719 ug/ml。
2.2.4 不同pH 值及對葛根黃酮含量的影響
體系環境的酸堿性也會影響菌種的生長。由圖7 可以看出，當體系的pH 值為5 時，黑曲霉生長最適應，葛根黃酮其濃度能達到最大值，為346.63 ug/ml。
2.3 超聲波萃取葛根黃酮產品
2.3.1 最佳單因素條件的復合實驗
通過單因素探討，確立出生物酶化法提取葛根黃酮的最佳實驗條件；取葛渣3.5ｇ，選定各最優單因素條件，進行最優單因素的復合實驗，經高效液相色譜法分析，譜圖如圖8（a）；測得葛根黃酮濃度為37.688ug/ml，葛根黃酮含量明顯高于任一單因素所得值；對照標品的液相色譜圖圖8（b），其峰型與出峰世界時間相似；此外，樣品譜圖在9 分鐘前還存在其他峰，說明采用生物酶促反應，還可以得到葛渣其他活性成分。
2.3.2 超聲波協助生物酶化反應提高產品含量
為充分提高葛根黃酮產率，在獲得生物酶化反應的最佳工藝條件基礎上，分別選用3.5克葛渣，通過提取產品量，考察超聲波協同作用。其結果見表1。從圖9 可知，生物酶化反應獲得葛根黃酮為1.446mg/g,而超聲波協同生物酶化反應獲得葛根黃酮為2.974 mg/g，含量明顯高于其他兩種反應，葛根黃酮含量結果表明超聲空化作用有助于破壞細胞膜，促進黃酮類化合物釋放與溶出,且超聲波的不斷震蕩和熱效應,不僅有助于溶質擴散,同時對原料起水浴作用。
3 結論
（1）從生物多樣性出發，采用生物酶促反應有助于葛渣中葛根黃酮溶出，并經超聲波協同處理葛根廢渣后，葛根黃酮含量較單一處理的產物高。
�。�2）從微生物發酵過程中影響因素出發，選用黑曲霉菌種，最優發酵工藝條件為：菌種接種量為50%，固液比為1：20，葛根渣與輔料之比為7：2，發酵溫度30℃，發酵時間60h，pH 值為5，能得到葛根黃酮濃度為37.688ug/ml，葛根黃酮含量為每克葛渣含葛根黃酮1.446mg/g；超聲波處理能得到2.974 mg/g。
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