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志賀菌敏感株與誘導耐多藥株蛋白質組學分析
【摘要】 目的 對志賀菌敏感株與誘導耐多株全菌蛋白進行蛋白質組學比較，尋找細菌耐多藥相關蛋白。方法 采用4類抗生素的次抑菌濃度，對臨床分離鑒定的志賀菌敏感株進行誘導耐多藥試驗；對志賀菌敏感株及誘導耐多藥株全菌蛋白進行雙向電泳；電泳圖譜采用Image Master 2D Platinum軟件分析；差異表達蛋白進行基質輔助激光解吸飛行時間質譜（MOLDI TOF-TOF質譜）分析。結果 成功獲得志賀菌誘導耐多藥株，在志賀菌敏感株與耐多藥株全菌蛋白質圖譜中分別檢測出（946±37）個和（1096±189）個蛋白質斑點；共發現48個差異表達的蛋白點，其中5個質譜鑒定為ABC轉運蛋白、谷胺酰轉肽酶、天冬氨酸氨甲�；D移酶、翻譯延長因子Tu、單鏈DNA結合蛋白；其中前3個蛋白中在耐多藥株中表達量增強，后2個減弱。結論 5個耐多藥相關蛋白中在細胞代謝中起重要作用的酶類表達量上調；ABC轉運蛋白在志賀菌誘導耐多藥機制中起重要作用。
【關鍵詞】 志賀菌
近年來，隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，造成志賀菌頻繁發生變異，產生耐藥株，且耐藥率高、耐藥產生速度快、耐藥范圍廣，給細菌性痢疾的防治帶來新的挑戰，因此，深入探討志賀菌的耐多藥機制成為目前解決志賀菌耐多藥的先決條件。本課題選用對抗生素敏感的1株志賀菌，以自身藥物誘導方式構建出多重耐藥菌株，通過比較敏感株與藥物自身誘導耐多藥株蛋白質雙向電泳圖譜，觀察與志賀菌耐多藥相關蛋白，并對部分表達差異蛋白進行基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MOLDI TOF-TOF)分析和數據庫檢索,旨在探索其耐多藥機制。結果報告如下。
1 與方法
1?1 材料
1?1?1 菌株 (1)福氏痢疾桿菌標準株：菌株號51571-9（中國藥品生物制品檢定所）； (2)敏感株：采用改良K-B紙片法，從臨床分離鑒定的志賀菌株中，篩選1株對頭孢噻吩(CF）、諾氟沙星（NOR）、慶大霉素（GM）、磺胺甲基異惡唑（SMZ）均敏感的福氏志賀菌作為敏感株。（3）誘導耐多藥株：使用志賀菌標準株和分離出的敏感株，參考文獻〔1〕的次抑菌濃度(1/2 MIC)誘導耐多藥方法，建立誘導耐多藥株。
1?1?2 試劑與儀器 頭孢噻吩等抗生素均為標準品(中國藥品中心)。固相pH梯度干膠條（immobiline pH gradient pH3～10,L=24cm ）；IPG緩沖液、IPG覆蓋液、兩性電解質pharmalyte(pH3～10)、3-［(3-膽酰胺丙基)-乙二胺］-1-丙磺酸(3-［(3-cholamidopropyl)- dimethylammonio］-1-propanesulfonate,CHAPS)(美國Amersham Pharmacia公司)。丙烯酰胺、尿素（urea）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、蛋白酶抑制劑丙甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑蛋白酶肽（leupeptin）(美國Sigma公司)。固相pH梯度等電聚焦儀IPGphor IEF System ,垂直板電泳儀、ImageScanner光密度掃描儀、圖像分析系統（美國Amersham Pharmacia公司）。
1?2 方法
1?2?1 蛋白質雙向電泳 （1）蛋白提取方法：采用超聲兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法〔2〕,略作改進。（2）可溶性總蛋白定量：應用BradFord法〔3〕對提取的可溶性總蛋白進行定量；（3）第一相固相pH梯度等電聚焦:按文獻〔4〕,程序分別為30V7h，60V7h，150V0?5h，300V1h，600V1h，8000V12h。（4）平衡：按文獻〔3〕。（5）第二相垂直板SDS-PAGE電泳：按文獻〔3〕。（6）染色：銀染按Amersham Bioscience的銀染方案稍作改進〔4〕�？捡R斯亮藍染色按Neuhoff等的方法進行〔5〕。（7）圖像掃描分析：用Amersham Bioscience的掃描儀投射掃描，分辨率為300dpi。數字化圖像文件運用Image Master 2D Platinum軟件分析。圖像分析過程包括蛋白質斑點的檢測、量化、背景扣除、匹配。蛋白質斑點經自動檢測后進行手工校對，匹配之前先選一塊膠作為參考凝膠，其他凝膠都與之匹配。
1?2?2 質譜分析 （1）質譜樣品制備：比較雙向電泳圖譜，找到差異蛋白，切下1mm×1mm×1mm，置于1?5ml的Eppendorf管中,按文獻〔6〕方法處理樣品。(2)質譜鑒定:樣品按照1∶1的比例,與含有α-氰基-羥基苯丙烯酸的50%乙腈/0?1%甲酸的溶液混合。所有質譜在4700 型MALDI TOF-TOF蛋白質分析系統下獲得。選擇反射式陽離子捕獲方式，質量精確度為50mg/L;MS光譜質量范圍800～4000Da。
1?2?3 數據庫檢索 光譜在全球蛋白服務工作站（Global Protein Server Workstation，GPS）進行處理和分析；搜索在NCBInr蛋白數據庫進行；鑒定GPS可信區間應>95％。搜索參數設置：相對分子質量誤差范圍±20%，肽片段相對分子質量誤差范圍±0?5Da，每個肽允許有1個不完全裂解位點，物種選擇細菌；蛋白質身份確定：根據搜索結果并結合蛋白質在凝膠上的等電點和相對分子質量進行最終確定；要求肽段覆蓋率>15%，匹配肽段至少4個，等電點和相對分子質量與觀察值基本相符。
2 結果
2?1 次抑菌濃度(1/2MIC)誘導耐多藥結果 志賀菌出發菌的抑菌濃度（MIC）分別為頭孢噻吩32mg/L，諾氟沙星0?5mg/L，慶大霉素2mg/L，磺胺甲基異惡唑512mg/L。將此出發菌在1/2MIC的LB培養基中傳代，最終得到MIC≥4倍誘導前的耐多藥菌株，分別是出發菌株的6，6，8，8倍。
2?2 蛋白質雙向電泳圖譜比較 (1)敏感株：相同實驗條件及參數設置情況下,對志賀菌可溶性總蛋白重復3次進行雙向電泳分離，發現3次雙向電泳圖譜非常相似，蛋白質上樣量為100μg，pH3～10,24cm線性干膠條通過Image Master 2D Platinum分析軟件對其進行點檢測，獲得(946±37)個蛋白質斑點(圖1)。(2)誘導耐多藥株：對志賀菌誘導耐多藥株可溶性總蛋白重復3次進行雙向電泳分離，獲得3塊凝膠的平均蛋白質點數為1096±189（圖2）。經過背景消減后，將其中1塊凝膠作為參考凝膠進行匹配，匹配點數為1078±26，其匹配率為98?36％。
2?3 2種菌株蛋白質差異表達譜分析 以誘導耐多藥株雙向凝膠圖譜為參考凝膠，與敏感株進行匹配，匹配蛋白質點數為637±16，匹配率為68?79％，共發現48個差異表達的蛋白點(表達量相差5倍以上的點為差異蛋白質點)，其中8個蛋白點只存在于誘導耐多藥株中，8個蛋白點只存在于敏感株中；在2種菌株中表達量相差5倍以上的32個蛋白點中，有26個蛋白點隨著志賀菌由敏感株向耐多藥株轉變而表達量增加，其余6個蛋白點表達量下降（圖3）。蛋白質上樣量100μg;第一向pH3～10，24cm非線性干膠條；
第二向應用12?5%聚丙烯酰胺凝膠(銀染)
圖1 志賀菌敏感株蛋白質雙向電泳圖譜 （略）
蛋白質上樣量100μg;第一向pH3～10，24cm非線性干膠條；第二向應用12?5%聚丙烯酰胺凝膠(銀染)
圖2 志賀菌誘導耐多藥株蛋白質雙向電泳圖譜（略）
圖3 志賀菌敏感株與誘導耐多藥株的差異表達蛋白（略）
2?4 質譜鑒定（表1） 在考馬斯亮藍染色的凝膠上選取5個差異點進行肽指紋圖譜鑒定，結果可見，200，201，98號蛋白點表達量增加，72，14號表達量下降。
表1 差異表達蛋白的質譜鑒定結果（略）
3 討論
三磷酸腺苷-組合轉運蛋白(ATP-Bmding cassettes transparters,ABC)外排系統為細菌耐多藥主動流出機制之一，腫瘤細胞膜上此蛋白過量表達，以便藥物順利進入細胞并很快被泵出，形成多樣抗藥性〔7,8〕。陳川等〔9〕在研究嗜水氣單胞菌耐四環素的蛋白質組學時發現，ABC轉運蛋白在耐藥株中表達量顯著增加；Bories C等〔10〕在研究利什曼原蟲的藥物作用原理及抗藥性中發現，ABC轉運系統在利什曼原蟲的抗藥性中起重要作用；Sipos G等〔11〕也發現，ABC轉運子在真菌的多藥耐受性中起重要作用。本文結果顯示，98號ABC轉運蛋白(ATP binding cassette transporter protei n) 在志賀菌誘導耐多株中表達量上調，表明雖然ABC轉運蛋白也存在于志賀菌敏感株中，但在志賀菌誘導耐多藥株中表達量明顯增加，將結構不同藥物泵出胞外，導致胞內藥物達不到有效濃度而導致細菌耐多藥，可見此蛋白在志賀菌的耐多藥機制中也起重要作用。本文結果還顯示，200號谷胺酰轉肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP）表達量增加，提示在長期低濃度藥物誘導作用下，轉肽酶參與的生物代謝反應中形成的一些生物介質可能在誘導耐多藥過程中起重要作用，從而使此酶的表達量增加，以滿足細胞在應急條件下生存所必需。從雙向電泳圖譜來看，201號天冬氨酸氨甲�；D移酶在誘導耐多藥株中明顯發生位移，分子量及等電點均增加，表達量也有所提高，推測在藥物誘導過程中，該酶可能發生某些基團的修飾作用，以適應新而生存。2006年，Tian-Yi Ying等〔12〕對福氏2a志賀菌2457T的外膜免疫性蛋白質進行雙向電泳肽指紋圖譜分析及蛋白印跡法檢測，發現翻譯延長因子Tu（Protein chain elongation factor ，EF-Tu）是志賀菌的外膜抗原蛋白。本次結果表明，14號EF-Tu在志賀菌的誘導耐多藥株中表達量降低，可能是其基因調控序列在長期藥物誘導過程中發生變異，使產物的表達量降低，或可能另一類能調節EF-Tu的翻譯延長因子Ts表達量降低，從而使EF-Tu活性降低，以適應細胞在不利環境環境中生存。72號單鏈DNA結合蛋白 (SSB) 在敏感株向耐多藥株轉變過程中表達量也有所下降。本文從全蛋白組角度探討了志賀菌的耐多藥機制，選擇志賀菌敏感株作為實驗菌株，通過藥物誘導產生誘導耐多藥株，排除了因菌株不同而導致的差異，可比性好。后續研究可能會發現更多與志賀菌耐多藥的相關蛋白，從而為志賀菌耐多藥分子機制及新型抗菌藥物開發研制提供基礎資料。
【參考文獻】
〔1〕 蘇林光,賈杰,潘光華.次抑菌濃度的藥物誘導細菌耐藥與交叉耐藥［J］.中國抗生素雜志,1997,22(4):301-303.
〔2〕 賈繼輝,于修平,郭輝玉,等.幽門螺桿菌蛋白質組雙向電泳圖譜的構建及其相關技術體系的建立［J］.山東大學學報：版,2003,41(3):225-227.
〔3〕 Marshak DR,Kadonagaj T,Burgess RR ,et al.蛋白質純化與鑒定實驗指南［M］//朱厚礎,譯.北京:科學出版社,2000：158- 159.
〔4〕 Berkelman T,Stenstedt T.2-D electrophoresis using immobilized pH gradients:principles & Methods［M］.Amersham Pharmacia Biotech Inc Press,1998：36.
〔5〕 Neuhoff V,Arold N,Taube D,et al.Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250［J］.Electrophoresis,1998,9:255-262.
〔6〕 Shevchenko A ,Wilm M,Vorm O,et al.Mass spectrometric sequencing of proteins Sil-stained polyacrylamide.gels［J］.Anal Chem,1996,68:850-858.
〔7〕 Johnstone RW,Ruefli AA,Smyth MJ.Multiple physiological functions for multidrug transporter P-glycoprotein［J］.Trends Biochem Sci，2000，25(1):1-6.
〔8〕 Kim RB.Transporters and xenobiotic disposition［J］.Toxicology,2002,181:291-297.
〔9〕 陳川,王三英,彭宣憲.嗜水氣單胞菌耐四環素的白質組學初步研究［J］.微生物學報,2004,44(3):396-398.
〔10〕 Loiseau PM,Bories C.Mechanisms of drug action and drug resistance in leishmania as basis for therapeutic target identification and design of antileishmanial modulators［J］.Curr Top Med Chem，2006，6(5):539-550.
〔11〕 Sipos G,Kuchler K.Fungal ATP-binding cassette (ABC) transporters in drug resistance & detoxification［J］.Curr Drug Targets，2006,7(4):471-481.
〔12〕 Tian-Yi Ying,Jun-Jun Wang,Heng-Liang Wang,et al.Immunoproteomics of membrane proteins of Shigella flexneri 2a 2457T World ［J］.J Gastroenterol,2005,11(43):6880-6883.
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