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腦缺血與凋亡相關基因的變化
畢業論文腦缺血與凋亡相關基因的變化
曹陽
廣州市紅10字會醫院
1般認為,腦損傷引起的急性期神經元死亡是以壞死為主,而繼發死亡或遲發死亡則以凋亡為主,
大約有50%的細胞死亡是由凋亡引起.前者發生在缺血后早期的中心區,后者多發生在缺血后的半影
區.細胞的凋亡與壞死其本質區別在于凋亡是1種主動死亡過程,伴隨基因轉錄和蛋白質合成,特征
性變化是DNA的寡核小體間裂解,在凝膠電泳時呈現特征性的"DNA梯".細胞凋亡的形態學特點是
細胞核染色質固縮,細胞膜發泡,細胞器緊縮,凋亡小體形成與呈現"DNA階梯"電泳圖譜.
細胞凋亡是機體在內外環境刺激下,啟動自身機制,由基因調控的細胞死亡過程,需新的mRNA
表達和蛋白質合成過程.細胞凋亡是1個瀑布式基因表達過程,許多基因包括原癌基因與抑癌基因均
參與細胞凋亡的調控,細胞凋亡過程中涉及某些基因的活化,并且受基因密碼的調控,因此有人將此
種由遺傳因素決定的細胞凋亡的基因稱為"凋亡基因".
研究資料顯示在腦缺血損傷中,神經元凋亡受到1系列基因的調控,腦缺血后有多種基因表達,
并編碼蛋白質產物介導凋亡的調控,包括促進凋亡的Bax,Bcl-xS,Caspases家族,NFκB,P53,Fas/Fasl
等,以及抑制凋亡的Bcl-2,Bcl-xL,HSP,cFos,sFas等等.
2,研究較多的凋亡相關基因家族
1 半胱天冬酶Caspases家族
半胱天冬酶Caspases家族屬于半胱氨酸蛋白酶家族.目前研究較明確的Caspase家族成員有10
余個.主要分為2大類,1是調控細胞因子成熟,誘導炎癥反應的白介素-1轉換酶(interleukin-1
cinverting enzyme)家族,如Caspase-1,4,5,11,12及14,等,另1類是直接參與凋亡的Caspase-2,
3,6,7,8,9等.進1步可以分為起始 Caspases(initiator caspases)和效應Caspases(effector Caspases),
起始 Caspases有1個較長的前區,與位于跨膜和胞內觸發凋亡的蛋白質的死亡結構域(the death
domains,DDs)起反應,并通過這1反應將1系列凋亡前刺激物激活,并使之具有蛋白分解活性;而
效應Caspases有1個短的前區,直接參與細胞內底物分裂,導致凋亡細胞形態學和生化特征改變.大
量證據表明腦缺血可以激活Caspases.神經元發生凋亡時Caspase-9被激活,并將 procaspase-3裂解,
產生具活性Caspase-3,進而酶解切割特異性底物PRAP [poly (ADP-ribose) polymerase],DNA依賴性
蛋白激酶(DNA-PK),類固醇調控元件結合蛋白(SREPB)等.許多研究表明,Caspase-3是關鍵蛋
白酶,處于級聯反應的核心位置并發揮重要作用,被稱為死亡蛋白酶.在實驗性大鼠短暫性半球和全
腦缺血模型中,在神經細胞死亡之前就可以觀察到Caspase-3 mRNA的上調和蛋白質激活,尤其是海
馬和尾狀核部位.
研究報道大鼠短暫全腦缺血可導致Caspase-3介導的ICAD(inhibitor of caspase-activated
deoxyribonu- clease)的分裂,產生CAD(caspase-activated deoxyribonuclease),進而DNA被CAD降
解,產生凋亡.相關報道大鼠短暫MCAO時,DNA酶活性可被具有抑制 Caspase-3活性的類似物所
抑制.研究表明持續性局灶性腦缺血,可有Caspase前體(Caspase-3,6,8)的mRNA和蛋白質水平
的增加,以及Caspase-3,8激活和PARP的分裂.大鼠腦室內注射選擇性Caspase阻滯劑2-DEVD-fmk
后,可減少細胞凋亡,具有神經保護作用.這表明 Caspase-3是促進腦缺血后神經元凋亡的1個重要
因素.另有報道動脈血栓栓塞性腦卒中患者發病數小時內,procaspase-3的水平有增加,但活性
Caspase-3和PARP碎片并未有明顯增加.在患者發生心臟缺血再灌注幾天后,在部分神經元細胞內可
以檢測到Caspase-3和89-kD的PARP分裂產物,表明Caspase-3可以導致神經元的遲發性死亡.
2 Bcl-2基因家族
Bcl-2 是從濾泡性淋巴細胞瘤中分離出來的1種癌基因.Bcl-2 家族可以分為3組.第1組包括
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Bcl-2,Bcl-xL,A1/Bfl1,Boo/Diva,Bcl-w,Mcl-1及Nrf-3,均含有4個與 Bcl-2相同的區域(BH1-4),
即含有1個疏水的C末端,通過它與內質網,核膜及線粒體外膜相連.第2和第3組則是凋亡前體(pro-
apoptotic),第2組C末端或者是缺乏BH4區 (Bax,Bak,Bok/Mtd)或者是具有BH4區,但缺乏BH1
和BH2區(Bcl-xS),第3組包括Bad,Bid,Bik/Nbk,Bim/Bod,Blk,Hrk,Nix,Bnip3,Noxa和
PUMA,只含有1個BH3區.Bcl-2在進化過程中高度保守,功能也相對保守,它通過阻斷細胞凋亡
而促進細胞存活,維持細胞生存,而Bax與Bcl-2功能相反,誘導細胞凋亡.Bcl-2和Bax 的表達強
度決定細胞命運,Bax占優勢時促進細胞死亡,Bcl-2占優勢時阻止細胞死亡).Bcl-2抑制細胞凋亡的
機制可能在于其與凋亡促進基因Bax拮抗,抑制細胞色素C自線粒體釋放至細胞質,阻止胞質內細胞
色素C對Caspase蛋白酶的激活,從而抑制凋亡.
研究發現,Bax基因是P53的下游基因,它單獨不足以啟動細胞凋亡途徑,多與Bcl-2,P53共同
參與并調節細胞凋亡,其作用具有2重性,Bax不僅能和Bcl-2形成2聚體(Bcl-2-Bax)抑制凋亡,
而且其自身還能形成2聚體(Bax-Bax)誘導凋亡.Bcl-x有兩種基因產物Bcl-xL和Bcl-xS,Bcl-xL
抑制凋亡,Bcl-xS拮抗Bcl-2和Bcl-xL的功能,促進細胞凋亡,兩者在凋亡調控中的確切作用機制與
Bcl-2的關系尚未完全闡明.Bcl-2選擇性與Bcl-xL2聚體,使得其與Bcl-2的親和力變小,代替Bax
調節Bcl-xL的抗凋亡作用.
動物實驗表明,短暫性局灶性腦缺血后20min海馬CA1區Bcl-2的表達開始升高,3天達峰值,
可持續7天.而在腦缺血后神經元細胞死亡之前,會出現Bax水平增高,同時在短暫性局灶性腦缺血
發生時,Bax可快速由胞漿轉移至線粒體,與線粒體的腺嘌呤核甘酸異位子及電壓依賴的陰離子通道
反應,促進細胞凋亡.在缺血再灌注損傷的動物模型中,Bcl-2過度表達可減少神經細胞凋亡,并可預
防海馬CA1區齒狀顆粒細胞凋亡.而另1方面,敲除Bcl-2基因,則神經功能缺失增加,梗死面積擴
大.總之,在Bcl-2家族中,抑制凋亡組有Bcl-2,Bcl-xL,促進凋亡組有Bax,Bcl-xS,Bad等.
3 核轉錄因子NFκB
NFκB最初發現于B淋巴細胞,與免疫球蛋白的κ輕鏈基因增強子的B位點結合,調控免疫球
蛋白的κ輕鏈的轉錄,NFκB的活化受 IκB(inhibitor-κ-binding)調節,NFκB根據其活化狀態分
為誘導型和結構型,誘導型指在 NFκB非活化狀態下,與其抑制蛋白IκB結合,存在于細胞質內;
結構型是指活化后在核內無IκB,能與DNA結合的形式.NFκB在CNS中廣泛存在,可見于大腦
皮質,海馬和小腦突觸上,神經元,神經膠質細胞與血管內皮細胞均可表達,與CNS的信號傳導有關.
NFκB是各種炎癥因子的中間調控環節,在凋亡中的作用較為復雜,過度的表達導致各種損傷,完全
不表達則不利于自身保護.研究表明,24h內的1過性NFκB活化,誘導神經元保護因子的表達,保
護缺血性腦損傷,而在海馬神經元中的持續表達,可促使海馬CA1區神經元死亡.
4熱休克蛋白(heatshockprotein, HSP)
HSP是機體應激反應中產生的1組特殊蛋白質.目前證實約有2百余種因素能刺激HSP的產生,
故又稱應激蛋白.HSP 主要功能是提高細胞對應激因素的耐受,維持細胞蛋白自穩,使細胞維持正常
的生理功能.研究較多的有 HSP70,HSP110, HSP72,HSP60等.研究發現,短暫腦缺血后,HSP70
等在腦缺血區明顯升高,其早期表達是細胞耐受缺血性損害的原因之1.其作用機制可能是依賴ATP
恢復正常核糖體裝配,促進新核糖體的合成及加速細胞核形態的恢復.
5 P53基因
P53 是促進細胞凋亡的重要基因,它通過激活1系列下游基因發揮促凋亡作用.P53作為1種抑
癌基因,其蛋白產物有野生型 (wt-P53)和突變型(mt-P53)兩種.mt-P53至今為止只在腫瘤細胞中發現,
與細胞的異常增殖有關;wt-P53作為1種抗細胞增殖蛋白,可誘導腫瘤細胞和神經元凋亡.另外,wt-P53
作為1種轉錄調節因子,可調節其他細胞周期相關基因,如p21基因,Bax基因的表達,同時降低Bcl-2
的表達,加速細胞凋亡.研究發現:大鼠大腦中動脈閉塞2h,再灌注6h時,神經元開始出現P53表
達,于再灌注12達高峰,隨后下降,蛋白表達位于神經元嚴重受損的區域.
6 Fas/Fasl
Fas是人們在研究膜蛋白抗體的溶細胞作用時被發現,進而從細胞毒T細胞系分離了Fas 的配體
(Fas ligand,Fasl),從而建立了 Fas/Fasl細胞凋亡信息傳遞系統.結構分析證實Fas是I型跨膜蛋白,
分子量45KD,屬腫瘤壞死因子(TNF)和神經生長因子(NGF)受體家族.Fasl是1種分子量約40KD
的II型跨膜蛋白,屬TNT家族成員.Fas含死亡結構域(DDs),與Fas 發生反應的蛋白是 Fas 死亡
結構域相關蛋白(Fas associated death domains,FADD),Fas與FADD通過DDs形成2聚體而相互作用.
FADD N末端稱為死亡效應結構域(death effector domain),該結構負責將凋亡信號傳遞至Caspase-8,
使之活化,從而啟動Caspase級聯反應,細胞產生凋亡 .研究發現,持續局灶性腦缺血可誘導Fas編
碼基因變異形成了sFas,其缺乏跨膜蛋白,sFas與Fas競爭結合Fasl,Fas與可溶性Fasl(sFasl)結合,
發出凋亡信號,并傳遞至細胞核內,調節基因轉錄而誘導靶細胞凋亡;而sFas缺乏跨膜蛋白的死亡結
構域(DDs),不具生物活性,sFas與Fasl結合后,信號無法通過細胞膜傳遞至胞內,從而抑制凋亡.
7 立早基因(immediateearlygenes,IEGs)C-fos與C-jun
IEGs是腦缺血后快速而短暫表達的1簇基因的統稱,現研究較多的有c-fos和c-jun家族.c-fos
和c-jun表達的蛋白是轉錄調控因子,通過形成2聚體的形式結合在靶基因的DNA相關序列即AP-1
位點,影響靶基因的表達,參與信號轉導.c-fos在腦缺血中是起保護還是損傷作用1直有爭議.有實
驗表明N-乙�；�-O-甲基多巴胺(N-acety-O-methyldopamine,NAMDA)在缺血刺激下能上調c-fos的表
達,CA1神經元c-fos的早期表達增加能上調存活基因的表達而產生神經保護作用.局部腦缺血后,
C-fos蛋白通過上調神經營養因子發揮神經保護作用,抑制C-fos蛋白的表達能使腦梗面積增大.也有
實驗表明局部腦缺血能誘導大腦皮質中C-fos和C-jun蛋白的大量生成,且與神經功能的缺陷程度成正
相關.使用血管緊張素受體拮抗劑能降低腦中C-fos和C-jun蛋白的表達,改善腦缺血損傷的恢復.
C-fos與C-jun均為原癌基因,正常情況下,C-fos與C-jun在神經元中僅呈極低水平表達,而腦缺
血與再灌注后即被快速而短暫地誘導表達.研究表明,大鼠大腦中動脈阻斷1h后,C-fos與C-jun mRNA
表達開始升高,主要位于半暗帶區和梗死周邊的正常組織.其促凋亡的機制可能為:其產物fos,jun
經亮氨酸拉鏈,聯合為雜合2聚體,即轉錄因子AP1,特異性與DNA上AP1結合位點結合而啟動晚
期效應基因的轉錄,從而促進凋亡.也有學者認為C-fos 的表達具有神經保護作用.在腦缺血研究中
發現,將形成梗死灶的缺血中心區C-fos不表達或輕微表達,而半暗區C-fos表達明顯.全腦缺血中,
能耐受缺血的齒狀回C-fos表達最快,最明顯,而海馬區(尤其CA1區)表達弱且延遲,說明其早期表
達對缺血后細胞的存活具重要神經保護作用.
3,展望
腦缺血后神經元凋亡受1系列基因調控.神經元凋亡可能是通過啟動細胞自身內部的死亡機制發
生的.我們前期研了大鼠腦缺血再灌注后Fas,TNFR1,p53,c-Myc,P-ERK,P-p38等在海馬區的表達
及Bcl-2過度表達對其的影響.結果發現,大鼠腦缺血再灌注后,Fas,TNFR1,p53,c-myc,P-p38
蛋白在海馬CA1區及CA3區均有表達,但CA1區強于CA3區;P-ERK在CA1區及CA3區亦均有表達,
但CA1區弱于CA3區;Bcl-2基因過度表達可明顯減弱Fas,TNFR1,p53,c-myc,P-p38蛋白的表達,
增強P-ERK蛋白的表達,說明Bcl-2除主要通過線粒體內在途徑發揮其抑凋亡作用外,還通過其他途
徑如死亡受體外在途徑(TNFR1,Fas)及DNA損傷機制等抑制凋亡.
目前有關腦缺血后神經元凋亡相關基因的表達研究越來越多且漸趨深入,隨著對凋亡基因研究的
深入及對凋亡機制的闡明,用干預基因表達的方法治療腦缺血是可以預見的具有潛力和突破性的手段.
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